CNS精读：一文看懂免疫调节分子的研究思路
- 2019 年 10 月 6 日
- 笔记
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甘露糖是葡萄糖的同分异构体，C-2 位羟基差向异构体，体内可与葡萄糖相互转换。甘露糖天然存在于许多植物和水果中，在人体血液中浓度不到葡萄糖浓度的五十分之一。
国自然申报无方向？甘露糖了解一下！（一），我们解读了《Nature》上的一篇有关甘露糖抗肿瘤的研究。并提出了一下五点思考：
今天我们精读的这篇是有关甘露糖与自身免疫病的，发表在2017年《自然·医学》（Nature Medicine, IF 32.62）杂志上（PMID:28759052），由美国国立卫生研究/NIH、四川华西医院、山东大学和南京鼓楼医院的研究人员共同完成。
TGF-β能在多克隆刺激情况下，促进初始T细胞中Foxp3的表达，促进它转化为具有免疫负调节的Treg细胞（regulatory Tcell)。FoxP3其特征性结构为蛋白C端的叉头螺旋（fork head winged helix）结构，DNA结合结构域，是决定调节性T细胞(Treg)发育、分化及功能的关键转录因子，对维持Treg细胞的免疫抑制活性至关重要的作用。
体外培养小鼠CD4+CD25−初始T细胞，培养基添加甘露糖和其他糖类做为对照。结果显示，D-甘露糖可增加Foxp3的表达，抑制初始T细胞的增殖，增强向Treg的转化。小鼠体内实验观察到了同样的现象。表明D-甘露糖可以提高体内Treg细胞的水平。
通过输注CD4+CD45RBhi-T细胞到Rag1−/−小鼠(免疫缺陷小鼠),诱导产生小鼠结肠炎模型。随后对比有或没有输注以下三种细胞后的结肠炎发病情况
- D-甘露糖诱导产生的Treg细胞
- TGF-β1诱导产生的Treg细
- CD4+CD25+Treg细胞
这三种Treg细胞均可有效抑制结肠炎症，提示甘露糖诱导的Treg细胞具有抑制能力。
实验结果显示Fos/TGFβ通路和Smad/TGFβ通路中FosS和mad7 mRNA增加,证明D-甘露糖的治疗可增强TGF-β信号转导。药物或抗体封锁TGF-β信号后，可抵消D-甘露糖引起的Treg细胞和Foxp3mRNA的增加。
TGFβ缺陷小鼠，甘露糖刺激Treg转化失败；Smad/TGFβ通路中Smad3缺陷小鼠，甘露糖刺激Treg生成量严重减少。体内试验也证明，输注抗TGFβ抗体可以抵消甘露糖引起的Treg细胞增加。
综上，体外细胞培养和体内试验均证明甘露糖诱导Treg细胞分化需要TGFβ的参与。进一步对于发现，单独的活性TGFβ作用很小，TGFβ1和潜在相关蛋白（latentassociated protein /LAP）联合才能明显刺激Treg分化。
已有研究表明整合素αvβ8和ROS（活性氧）参与TGF-β激活免疫细胞,该研究发现 d-甘露糖可刺激CD4+T幼稚细胞中Itgav和Itgb8 mRNA表达增加。体外整合素β8缺陷的T细胞甘露糖刺激效果明显降低甘露糖的刺激可显著增加细胞内ROS的产生，封闭ROS可显著减弱甘露糖的刺激效果。整合素αvβ8和ROS均参与甘露糖诱导的Treg生成，且是两条相互独立的途径。
- 无糖培养基中添加葡萄糖或甘露糖，检测细胞外酸化率发现，甘露糖培养基细胞酸化率明显低于葡萄糖，表明糖酵解能力下降。
- 分别检测幼稚CD4+在甘露糖和葡萄糖培养下的耗氧量（OCR），甘露糖组OCR明显更高
- 同时抑制两组的线粒体脂肪酸转运，发现甘露糖培养细胞的OCR下降，而葡萄糖组的OCR没有出现这种下降，这表明，甘露糖组的 OCR增加的一部分可归因于脂肪酸氧化FAO。
综上，甘露醇培养的T细胞培养优先使用FAO,从而导致较高的活性氧水平ROS,从而导致更多的TGF-β激活。
为了验证甘露糖与自身免疫病之间有无联系，该研究首先构建了Treg缺陷的I型糖尿病小鼠模型，实验组于7.5周龄（此时小鼠模型的血糖水平正常，胰岛略异常的糖尿病前期阶段）时开始在饮水中添加20%的D-甘露糖。
上图中，a：D-甘露糖补充小鼠（黑色圆形）和对照组小鼠（白色圆形）未患糖尿病鼠的数量变化；b：D-甘露糖补充小鼠（下）和对照组小鼠（上）胰岛细胞数量的对比（箭头所指）。
检测小鼠13-14w时的T细胞反应：
- D-甘露糖处理小鼠脾脏和胰腺引流淋巴结(DLNs)中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞频率明显高于未处理小鼠。
- 当NOD小鼠一旦达到高血糖指标，即予以甘露糖处理，结果显示可以抑制糖尿病的进展。
- 无论是预防（7.5w时给予甘露糖）还是治疗（达到高血糖标准时），在NOD小鼠具表现为：Treg细胞的频率显著增加与TH1细胞和CD8+IFNγ+ T细胞频率的显著降低。
为了研究Treg细胞数量的增加是否与d-甘露糖介导的糖尿病抑制有关，研究人员用抗CD25抗体耗尽两组小鼠的CD4+CD25+reg细胞。CD4+CD25+ Treg细胞的耗竭破坏了d-甘露糖对糖尿病发展的保护作用，使得胰岛炎进展以及胰岛数目难以维持，用anti-TGF-β中和内源的TGF-β显示相同的效果。综上：D-甘露糖可以抑制自身免疫性糖尿病（NOD小鼠）的免疫病理反应，Treg细胞和TGF-β均参与其中。
与对照组相比，D-甘露糖处理组：可以预防肺部气道炎症的进展，炎症细胞浸润量明显减少，气道黏液生成减少，炎症白细胞特别是嗜酸性粒细胞明显减少；小鼠肺、脾脏和DLNs中KJ1-26+CD4+Foxp3+ Treg细胞数量显著增加。结论：d-甘露糖可诱导小鼠体内抗原特异性Treg细胞，抑制气道炎症的免疫病理，表明d-甘露糖介导的免疫调节功能广泛。
看完这篇文献之后是否能打开跟多科研思路呢？一下几点思考，抛砖引玉。
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