單細胞測序下的骨髓微環境
- 2020 年 3 月 30 日
- 筆記
當你的才華還撐不起你的野心時，請潛下心來，腳踏實地，跟著我們慢慢進步。不知不覺在單細胞轉錄組領域做知識分析也快兩年了，通過文獻速遞這個欄目很幸運聚集了一些小夥伴攜手共進，一起成長。
文獻速遞欄目通過簡短介紹，擴充知識面，每天關注，希望你也能有所收穫！
文章資訊
今天分享的文章於2019年4月發表於Nature，文章利用單細胞轉錄組聯合突變分析研究急性髓性白血病（AML），揭示AML病人體記憶體在不同功能子集及其相關的驅動因子。文章標題：The bone marrow microenvironment at single-cell resolution
摘 · 要
在本研究中，在體內平衡和應激誘導的造血條件下分別構建了小鼠骨髓血管，血管周圍和成骨細胞群的單細胞轉錄組圖譜。該研究揭示了骨髓龕中先前未被認可的細胞異質性水平和闡明了造血生長因子，趨化因子和膜結合配體的細胞來源。我們的研究表明，在壓力條件下，包括血管周圍細胞的脂肪細胞傾斜在內的骨髓龕的轉錄重塑相當大。應激條件下，觀察到由DIl1和DIl4編碼的血管Notch delta樣配體基因表達下調。在無血管DII4基因存在的情況下，造血幹細胞會過早地誘導髓樣特徵的轉錄進程。以上這些發現重塑了人們對骨髓龕細胞結構的認知，揭示對壓力極其敏感的動力學和異質性分子圖譜，同時表明單細胞轉錄組數據在評估離散龕細胞群體在造血功能的調節中的效用。
背景
造血-產生成熟血細胞的過程-對於發揮各種功能至關重要，例如氧運輸，免疫防禦和組織重塑。這一相當大的工作由罕見的自我更新造血幹細胞（HSCs）維持，該幹細胞維持在由瘦蛋白受體陽性（LEPR +）的間充質基質細胞和血管內皮細胞組成的特化骨髓微環境中。先前已提出成骨細胞支援早期淋巴祖細胞存活和維持。交感神經纖維細胞，巨噬細胞，巨核細胞和非髓鞘化施萬細胞提供額外的訊號（細胞因子），這也有助於HSC龕。前期的研究表明，骨髓結構中存在有血管細胞和間質幹細胞介導的更深程度的細胞複雜性。必須以精確和快速的方式控制造血，來滿足體內穩態和環境壓力條件的不同需求。儘管我們對骨髓龕的理解在過去幾十年中已經有了很大的發展，但是解決骨髓微環境的分子異質性和功能可塑性的研究任然有限，這主要是由於骨髓中靶標細胞的數量太少及分離技術的局限性。在本研究中，我們分析了小鼠骨髓龕中的17,374個單細胞，識別出了骨髓微環境中以前未被認識到的異質性，並揭示了微環境是如何在單細胞水平對急性骨髓應激作出反應。我們將轉錄分析與熒光報告基因和功能研究相結合，來證明我們的單細胞研究所鑒定的Notch受體DLL4的血管表達抑制了HSC中髓樣程式的過早上調。
測序數據介紹
文庫構建：The libraries were prepared using the Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits (v2): Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v2 (PN-120237), Single Cell 3′ Chip Kit v2 (PN-120236) and i7 Multiplex Kit (PN-120262) (10x Genomics) 61 , and following the Single Cell 3′ Reagent Kits (v2) User Guide (manual part no. CG00052 Rev A). Libraries were run on an Illumina HiSeq 4000 as 150-bp paired-end reads, at one full lane per sample。
分析了小鼠骨髓龕中的17,374個單細胞的轉錄組。
數據分析情況
- 數據過濾：Sequencing results were demultiplexed and converted to FASTQ format using Illumina bcl2fastq software. The Cell Ranger Single-Cell Software Suite was used to perform sample demultiplexing, barcode processing and single-cell 3′ gene counting.
- 比對: 參考基因組mm10/GRCm38 reference genome
- 基因過濾：使用Seurat R軟體包進行數據過濾，識別高可變的基因，降維分析，標準的無監督聚類演算法，獲得差異表達基因
- 細胞過濾：除去基因數量小於1000的低品質細胞和含有超過10%線粒體基因的細胞
- 可視化：使用t-SNE，基於對齊的典型相關分析降維，在二維空間中細胞投影。
- 聚類分析：Aligned canonical correlation analysis was also used as a basis for partitioning the dataset into clusters using a shared nearest neighbour modularity optimization algorithm.
- 數據獲得：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE108892
主要分群情況
識別正常骨髓樣品種的細胞類群
作者識別出兩個內皮、4個血管周圍和3個骨細胞系的細胞亞群及一個小的（70）個增殖細胞簇 (Fig. 1c, d, Extended Data Fig. 1e)。作者僅關注骨髓龕的大的細胞亞群，還可以用於其他分析（數據挖掘黨的福音）。作者分別分析了內皮細胞亞群、管脈細胞亞群和骨細胞系亞群的特徵和相關基因的檢測。
Fig. 1
Fig.2
鑒於LEPR+細胞群體具有多譜系分化潛能和間充質幹細胞活性，該細胞群體的異質性一直是個懸而未決的問題。作者通過綜合分析從LEPR+細胞群體中識別出4個明顯的簇（P1、P2、P3、P4）。P1 (Mgphigh )和P2(Lplhigh ) 簇表達成脂相關的標記基因。
分析正常組的LEPR+細胞群體有明顯的和3個（P1、P3和P4）簇，結合分析處理組得到P2簇（一個成脂前體細胞狀態而非一個祖細胞）。P3 (Wif1high) 和P4 (Spp1highIbsphigh)為LEPR+細胞群體中成骨蓄勢待發的類群，因為成骨相關的基因的表達水平隨著時間日益增高。LEPR+細胞群體表達P3和P4簇的特異性基因標記CD200（由Cd200編碼）和CD63（由Cd小梁63編碼），該標記主要位於骨部分。
COL2.3+細胞類群可以由其轉錄本分為三個亞群。簇O1（Col16a1highTnnhigh）表達高水平的破骨細胞（由Ostn編碼）和血管生成素樣2（由Angptl2編碼），以及DEL-1（由Edil3編碼），其最近研究已證明其可調節骨髓細胞生成。亞群O2（Fbn1highIgf1high;擴展數據圖5a）既表達成骨細胞也表達軟骨細胞特異性基因。簇O2與表面標記CD9相關。由於簇O3（BglaphighCar3high）顯示出COL2.3（Col1a1）和成骨相關基因的最高表達，它代表成熟的成骨細胞（圖2c）
骨髓龕的應激反應特徵
常用於治療白血病的化學療法會導致造血祖細胞的消耗，並誘導其他靜默狀態造血幹細胞的增殖和分化。骨髓消耗影響竇狀血管和基質細胞，並導致骨髓脂肪細胞的增加。為了研究急性應激條件下骨髓龕的動態分子和形態變化，作者給予單劑量的5-氟尿嘧啶（150 mg.kg -1）。在治療後第5天，檢測到骨髓細胞數，Lineage（Lin）-SCA-1 +CD117 +（LSK）骨髓細胞以及骨髓血管和血管周圍細胞總數的顯著下降。
為了追蹤應激性造血過程中骨髓龕中基因表達的變化，我們用5-氟尿嘧啶處理了7,752個細胞（圖3）
Fig. 3
結果表明脂肪細胞引發的簇（P5，n = 161）（圖3b）的形成以及整個LEPR+和COL2.3+群體中簇貢獻的變化。
5-氟尿嘧啶處理後的LEPR+細胞群體，脂肪相關的基因表達上調，成骨相關的基因表達下調。
5-氟尿嘧啶處理後對造血因子的影響。上調的基因有：vascular Ang, perivascular Il7 and Bmp4 and osteo Wnt5a；下調的的基因有：vascular Notch delta-like ligands Dll4 and Dll1, the adhesion molecule Sele and perivascular Wnt4。(圖5)
臨床意義
越來越多的證據表明偏離了傳統的造血分層模型，而是建議每個HSC能夠區分不同的血統。很有可能這樣的可塑性是由HSC和微環境的組成部分之間的獨特相互作用決定的。我們的研究結果通過提供骨髓生態位的不同血管，血管周圍和骨系組成部分的詳細轉錄藍圖，擴展了對骨髓生態位的理解。本研究，結果表明單細胞轉錄組分析可以轉化為機制明了幹細胞和祖細胞分化的調節。作者將造血因子與其細胞來源相匹配，並顯示血管-內皮細胞表達的Notch配體DLL4的缺失使骨髓造血傾向於HSPC的顯著的轉錄重編程和髓樣發生。將來的研究需要研究骨髓龕異質性對功能異常幹細胞的影響，如免疫缺陷，造血系統惡性腫瘤和衰老。靶向骨髓龕相關因子可能干擾疾病的發生和發展，最近已經有研究通過靶向急性淋巴細胞白血病中的血管CXCR4-CXCL12相互作用顯示出來。
