乾濕結合發6.68分，這樣的套路給我來一打

2020 年 2 月 19 日
筆記

目前，純生信分析發文依然是如火如荼，但隨著審稿人的審美疲勞，其口味也越來越挑。純生信文章不再那麼容易滿足審稿人的味蕾了，所以，「生信分析+實驗驗證」也是目前生信類高分文章的整體套路。到底怎樣將生信分析與實驗驗證完美的整合呢？今天，一起學習一篇6.68分的文章，看看「別人家的套路吧」！

文章的題目是：Identification of AUNIP as a candidate diagnostic and prognostic biomarker for oral squamous cell carcinoma.

下面，和大家一起分解作者的套路：

一、研究材料

臨床樣本

包含89個口腔鱗狀細胞癌(OSCC)樣本和16個正常對照樣本(癌旁組織) 組織微陣列晶片。另外是4對OSCC和相匹配的正常口腔組織樣本。這些臨床樣本均含有臨床病理特徵的數據。

生信數據

從GEO資料庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中選擇了GSE30784，GSE3524，GSE78060，GSE41613四張晶片，然後下載原始文件（.CEL文件）和平台文件(GPL文件)。使用R/Bioconductor中的「affy包」和「impute包」對每個GEO數據集的矩陣數據進行背景校正，歸一化，log2轉換和缺失值補充。GEO數據就處理完了。通過TCGA資料庫（https://www.cancer.gov）和FireBrowse資料庫（http://www.firebrowse.org）中下載與OSCC相關的相關文件（.count文件）和臨床資訊。

二、上調差異表達基因(DEG)的篩選

以log2FoldChange(FC)＞1且adjusted P-value＜0.01作為上調差異基因的篩選標準，篩選GSE30784, GSE3524，and GSE78060三張晶片中上調的差異基因，然後求三張晶片的交集，最終篩選出來了90個重疊的上調的DEG,再利用TCGA資料庫對這90個上調的DEG進行驗證，結果是一致的。

上調的DEG交集的韋恩圖：

TCGA資料庫驗證的熱圖：左邊是正常組織，右邊是腫瘤組織。

三、鑒定診斷OSCC的關鍵基因

通過ROC曲線分析，並比較AUC值，以評估上述90個候選基因在TCGA資料庫中診斷OSCC的敏感性和特異性。根據其AUC值（＜0.940）列出了TOP10基因，表明這些基因對OSCC的診斷意義最高。為了驗證這10個基因對OSCC的診斷意義，再次在GSE30784數據集中進行了ROC曲線分析。

AUNIP在癌症中的表達和功能不明確，因此，作者提出了AUNIP作為本研究的目標基因。確定了目標基因後，建立Logistic回歸模型，以進一步評估AUNIP在診斷OSCC中的有效性。通過構建五倍交叉驗證的AUNIP的ROC曲線和混淆矩陣，結果明確了AUNIP在OSCC樣本中的診斷價值。

四、AUNIP的高表達與OSCC的進展和

腫瘤純度的分析

利用TCGA數據，首先是正常樣本與腫瘤樣本的差異比較(a)；其次分析了AUNIP的不同表達水平與OSCC患者臨床病理特徵之間的相關性，HPV感染、基質評分、免疫評分、組織學分級、腫瘤T分期這五個特徵均得出了有統計意義的差異。

通過分析，AUNIP的表達與ESTIMATE得分(使用TCGA樣本的表達數據估計惡性腫瘤組織中的基質細胞和免疫細胞的值)呈負相關，表明AUNIP與OSCC的腫瘤純度呈正相關。

最後，再通過Western blotting和IHC染色檢測AUNIP的蛋白表達，其結果與OSCC組織中的mRNA表達一致。Western顯示了OSCC患者中AUNIP過表達（圖a）。在IHC染色中，與正常對照（圖b-c）和成對的相鄰正常口腔組織（圖d）相比，OSCC組織中的AUNIP過表達。通過IHC染色的ROC曲線分析獲得的AUC值為0.725，且具有統計學意義，支援AUNIP對OSCC的診斷價值（圖f），並且AUNIP蛋白表達隨著惡性腫瘤的進展而增長（通過組織學等級的改變來反映：圖c；圖e）。以上實驗得出了AUNIP在OSCC中的潛在致癌作用的結論。

五、WGCNA網路構建和關鍵模組的識別

還記得之前剩下的一個GEO晶片GSE41613嗎？GSE41613數據集包括97名OSCC患者，並提供詳細的總體生存資訊，適合於WGCNA的構建。所以可以將模組特徵基因與OSCC患者的生存數據聯繫起來。通過WGCNA，發現黃色模組與OSCC患者的生存時間最相關，而AUNIP是MM>＞0條件下的基因之一，因此，AUNIP被認為是黃色模組中的中樞基因之一。