单细胞全基因组测序—直肠癌的异质性

2020 年 3 月 30 日
筆記

呐，等你关注都等出蜘蛛网了~

当你的才华还撑不起你的野心时，请潜下心来，脚踏实地，跟着我们慢慢进步。不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，通过文献速递这个栏目很幸运聚集了一些小伙伴携手共进，一起成长。

文献速递栏目通过简短介绍，扩充知识面，每天关注，希望你也能有所收获！

文章信息

这次介绍的是一篇2017年发表在BMC cancer上的文章，文章题目是：Multi-region and single-cell sequencing reveal variable genomic heterogeneity in rectal cancer 。

本篇文章对相同分子分类的肿瘤的两个直肠癌患者的9个肿瘤区域和88个单细胞进行了测序，并且在多区域和单细胞水平上表征了它们的突变谱和体细胞拷贝数的改变（SCNA）。通过单细胞测序发现SCNA是在肿瘤发展的早期就会发生的事件，并且在细胞增殖过程中变异的SCNA会稳定的遗传。

样品准备

文章是选取了两例原发性肿瘤切除后的患者又新发的原发性直肠肿瘤，在手术切除后立即从肿瘤的不同区域收集切片，同时收集外周血作为对照组。通过FACS筛选出肿瘤细胞。

全外显子测序

文库准备与测序

使用QIAamp Micro DNA试剂盒（QIAGEN，US）提取组织切片和外周血的单细胞悬液中的基因组DNA，定量、打断，使用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒（Agilent Technologies，US）建库，用Hiseq4000 2×150-bp PE测序，深度为100X

WES分析

WES分析就是常规的分析流程，比对>>排序>>去重>>找变异>>注释结果，一般的分析过程可以参考Jimmy老师的推文(https://www.jianshu.com/p/49d035b121b8)

本文中的上游分析流程为：用Burrows-Wheeler Aligner比对人的参考基因组（hg19，USCC），用Samtools 0.1.19合并bam文件。先使用GATK 1.6和multiSNV 识别多区域WES中的INDELs 和SNVs ，然后用multiSNV 找SNVs，最后手动筛选合并获得可信的SNVs列表。

SCNA分析

用肿瘤区域和匹配的外周血构建gDNA文库。比对合并与WES分析是一致的。为了可视化WGS的SCNA图谱，作者们将整个基因组分类为500Kbbin，然后使用匹配的外周血作为对照去除噪音。最后，沿着染色体的顺序绘制肿瘤区域的每个区域的深度。

单细胞全基因组

文库准备与测序

裂解单细胞，然后使用multiple annealing and looping-based amplification cycles (MALBAC)扩增单细胞，定量、打断，用NEBNext Ultra DNA Library Prep制备文库，用HiseqXTen 2×150-bp PE测序，测序深度约为0.3X

单细胞WGS分析

单细胞的测序数据通过median of the absolute values of all pairwise differences（MAPD）评估。最终获得88个细胞。通过gplots包中的heatmap.2函数绘制large-scale copy number profiles的热图，使用stats包中的prcomp函数执行主成分分析（PCA）。使用fpc包中的pamk函数执行围绕medoids（PAM）聚类的分区。

单细胞SCNA分析

单细胞的SCNA分析与全外外显子组分析几乎完全一致，只是在将整个基因组分类为500Kbbin后，使用隐马尔可夫模型确定每个bin的深度。

鉴定subclonal SCNAs

使用FactoMineR包基于每个箱的深度（每个患者在500Kb具有6037个箱）通过PCA鉴定单细胞的亚克隆SCNA，并用gplots包可视化。

临床意义

单细胞WGS和bulk的WES能够检测到相似的SCNA profiles，但是单细胞WGS能更加清晰的检测到局灶性SCNA，可以更好地发现肿瘤的详细遗传特征。说明了不同患者之间存在着差异性，需要个性化治疗~

个人吐槽

这篇文章就用了两个病人的数据，总共就检测了88个细胞，数据量实在是少的可怜。分析方法也是用的已经报道的，没有改进。最后的结论是不同病人间的肿瘤存在异质性，这不是废话么……同一个人的不同位置的肿瘤还有异质性呢

最后作者们提出的临床意义，谁都知道个性化治疗好啊，可是怎么给制定方案啊，医生要检测什么参考哪些指标给出什么药物组合统统没有提。总之，这篇文章没有太多值得深挖的，创新点应该是把单细胞全基因组技术用在了直肠癌的病人样品上吧~

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