多靶點自體免疫細胞技術

• 2020 年 3 月 27 日
• 筆記

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文章資訊

本期文章題目是 Immune recognition of somatic mutations leading to complete durable regression in metastatic breast cancer 發表於 Nature Medicine (2018)

本文重點在實驗設計環節，但是現在的大文章或多或少都引入多組學數據，本文也不例外，實驗納入的唯一一個病人既做了全外顯子又做了轉錄組測序，還有單細胞測序。不過數據公開的是 PRJNA342632 for exome data and PRJNA243084 for RNA-seq data

背景知識

腫瘤免疫療法

近年來，腫瘤免疫療法已成為繼手術、放療和化療之後的第四種腫瘤治療手段。

腫瘤免疫治療，主要包括

• 免疫疫苗
• 免疫檢查點抑製劑治療
• 過繼性免疫細胞治療
• 細胞因子治療

其中以CTLA4、PD1/PDL1抑製劑為代表的免疫檢查點抑製劑，以其顯著的臨床療效而備受矚目。

而本文的研究屬於腫瘤免疫治療的過繼性T細胞療法（ACT）領域，之前以CART為主，最近出現了另外一種療法——TIL（Tumor Infiltrating T cell，腫瘤浸潤淋巴細胞），表現也十分驚艷，Rosenburg博士及其團隊就是這一領域的代表。

腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)

腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte, TIL）指的是從腫瘤組織中分離出的浸潤淋巴細胞。

1986年，Rosenberg研究組首先報道了TIL細胞。TIL細胞表型具有異質性。一般來說，在TIL中，絕大多數細胞是CD3陽性的。在不同腫瘤來源的TIL細胞中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞的比例有差異，但大多數情況下以CD8+T細胞為主。

不同患者不同腫瘤類型對免疫療法的反應不可預測，是因為免疫成分的異質性以及腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）在單個腫瘤內和患者之間的多樣化表型。

並不是所有的腫瘤浸潤T細胞都是針對腫瘤抗原的，並且發現檢測CD39的表達可以簡單的量化或分離Bystander 即「旁觀者」T細胞。

技術歷史

早在2014年的時候Rosenburg博士的團隊就將其一部分研究結果發表在Science期刊（Tran E et al, Science 2014）上，當時他們的做法是：把一名晚期膽管癌女患者的肺轉移腫瘤病灶拿來做全基外顯子測序，找到了26個非同義突變，並為每一個突變構建了一段短基因，將這些短基因幾個一組地串聯成短基因串（Tandem Minigene, TMG），然後將這些短基因串轉入抗原遞呈細胞（指樹突狀細胞DC）並與腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）共同培養，以查看患者的TIL中是否存在可以特異性識別腫瘤突變的T細胞。不出所料，這位患者的TIL可以識別腫瘤的一個突變。研究者將這個有識別功能的T細胞體外大量擴增後再回輸給患者，患者肝部的轉移灶長期穩定狀態達1年以上。Rosenburg博士的團隊通過這個研究，證明了晚期癌症患者的腫瘤組織中確實是存在可以對抗腫瘤突變的淋巴細胞的、即便是在晚期膽管癌這樣兇險又難治的瘤種。

參考自：腫瘤資訊。

但是從實體瘤中收集浸潤性T細胞確實比較有挑戰性，而與之相比，抽取患者的外周血則容易得多，所以2016年Steve Rosenberg小組發表在《自然-醫藥》雜誌上的文章《Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients》即是從晚期惡性黑色素瘤患者的外周免疫細胞中可根據PD-1受體表達找到針對腫瘤變異新抗原的活性殺傷T細胞。這樣找到的T細胞在體外增殖後和腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）一樣可以識別患者自身腫瘤。

但是惡性黑色素瘤是一種突變比較多的腫瘤，儘管外周血抗腫瘤細胞比例低，但是仍然能夠分離出來；而其他突變較少的腫瘤在外周血中是否同樣存在這樣的T細胞就存疑了。

多組學測序

雖然作者本文只探索了一個病人，但是它上傳了很多數據在，對這個病人測了：

• FrTu (118×)
• OCT (120×)
• normal blood (116×)

也是常規的腫瘤外顯子數據分析流程，其實就是GATK best-practices 流程加上 varscan2，再使用 『allele-specific copy-number analysis of tumors』 (ASCAT) 和Sequenza 來分析腫瘤純度和倍性，然後得到的somatic 變異過濾如下：

• tumor and normal read counts of 6 or greater,
• variant-allele frequency (VAF) ≥ 5%
• tumor-variant reads ≥ 3

其RNA-seq測序也是走的STAR比對加上GATK best-practices 流程來找變異。

最後使用 PyClone 進行克隆進化分析。

首先看somatic變異

這裡過濾後剩下 62 nonsynonymous somatic 變異位點

TIL識別的兩個基因突變

通過與前面文章類似的方法，構建TMG來挑選病人那些可以特異性識別這些突變的TIL細胞。本次使用使用了pulsed peptide pools (PPs 1–6) or transfected mRNAs (tandem minigenes (TMGs) 1–6)

得到的結果如圖：

• The reactive F13 TIL recognized mutant ECM29 proteasome adaptor and scaffold (ECPAS; also known as KIAA0368)
• Individual peptide screens of the TIL fragments showed F8 and F12 recognized the solute carrier family 3 member 2 (SLC3A2) protein

單細胞測序識別兩個基因突變

挑選那些高表達T cell receptor (TCR)-β variable (TRBV) region or high expression levels of 4-1BB (CD137, a marker of T cell activation)的T細胞做單細胞測序，找到了跟mutant (mut)-SLC3A2 or mutKIAA0368對接的TRBV

然後TIL回輸之後， FACS-sorted TRBV28+ cells showed specific recognition of PP6 and TMG6，如下圖

又對應到了兩個突變：

• calcium-dependent secretion activator 2 (CADPS2; p.Arg1266His)
• cathepsin B (CTSB; p.Asp159His)

整個實驗比較幸運，對這個病人來說，發現了 11 TCR clonotypes recognized the four neoantigens (SLC3A2, KIAA0368, CADPS2 and CTSB)

總結

其實我看的不是很懂，可能就是明白其中的組學數據分析環節吧，而且作者單細胞測序也說的不清不楚的。

但是這個作者持之以恆的發大paper，應該是很牛吧。