qiime2+picrust1學習筆記

一直迷惑於如何把qiime2和picrust結合起來用來分析16S的數據，直到這兩天，看到了微生太公眾號的影片教程，才有了眉目，原來如此。詳細影片教程可以查找相關公眾號獲得。前面看到picrust2已經處於beta狀態了，其可以嵌入於qiime2中，使用更方便，可是我的試用結果卻差強人意，或許是我的使用過程有問題，16G記憶體的要求一般的電腦也難以實現。之前使用picrust1網頁版（Galaxy平台，不是三星的那個，是個生物資訊雲平台軟體系統）分析的效果還可以，於是決定用picrust1再試試。發現pcirust在今年6月份更新了1.1.4版。

再來吐槽幾句這個功能預測，雖然大部分預測準確率挺高，還是不能說明真正的問題，畢竟真實的宏基因組才是最準的，隨著測序成本的降低，功能預測有一天也許會成為歷史。地球上人與人之間的DNA的差別在0.03%（算上SNP，CNV和indel等等），而細菌菌屬間的差別遠比這差得多（由於基因間的水平轉移等），所以只是參考。

剛剛搜索了一下，PICRUSt2已經於預印版發布了，6月份發布的，文章地址在這，閱讀原文，也可以看到文章。晚會再學習一下這篇文章。

一、所需文件下載

這裡我是直接使用qiime2官方教程里的文件，（一不小心又發現qiime2也更新了，軟體更新可真快呀！）https://docs.qiime2.org/2019.7/data/tutorials/otu-clustering/table.qza ， https://docs.qiime2.org/2019.7/data/tutorials/otu-clustering/rep-seqs.qza ， ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_5_otus.tar.gz 參考影片教程的腳本里的命令來完成的。腳本里是根據他們商業化報告來處理的，這裡我們是直接從qiime2分析我是來的數據，所以基本不需要文件導入qiime2這一操作了，otu參考數據還是需要導入一下的。

二、處理成picrust1所需

#解壓greengenes-13-5參考資料庫  tar zxvf _otus.tar.gz  #找到這個文件gg_13_5_otus/rep_set97_otus.fasta，可以把它放在工作目錄，這就是我們要使用的參考序列  #因為一般只是測16s-V4區，所以常規分析絕大部分只能到屬，所以選擇97%相似度  #安裝好qiime2，然後導入成qiime2格式，方便後面使用  qiime tools import   --input-path ../97_otus.fasta --output-path ref-sequences.qza --type 'FeatureData[Sequence]'  qiime vsearch cluster-features-closed-reference --i-sequences rep-seqs.qza --output-dir closed-ref-otu/ --i-table table.qza --i-reference-sequences ref-sequences.qza   --p-perc-identity 0.97  qiime tools export --input-path closed-ref-otu/clustered_table.qza --output-path closed-ref-otu/  biom convert --to-tsv -i closed-ref-otu/feature-table.biom -o closed_reference_otu_table.tsv

三、使用網頁版軟體或者手動安裝

使用網頁版的就很簡單了，只是手動點點就好了，上傳biom或者tsv格式。下面是我的軟體安裝和使用步驟，軟體安裝參考官方教程，使用參考宏基因組微信公眾號。

1.軟體安裝

#使用已經安裝好的miniconda安裝，簡便快捷  conda create -n picrust1 -c bioconda -c conda-forge picrust  #下載所需資料庫  wget http://kronos.pharmacology.dal.ca/public_files/picrust/picrust_precalculated_v1.1.4/13_5/ko_13_5_precalculated.tab.gz  wget http://kronos.pharmacology.dal.ca/public_files/picrust/picrust_precalculated_v1.1.4/13_5/ko_13_5_precalculated.tab.gz  #建立data文件夾  mkdir -p /Volumes/MacOS/Miniconda3/envs/picrust1/lib/python2.7/site-packages/picrust/data  #複製資料庫文件到文件夾，不需要解壓  cp ko_13_5_precalculated.tab.gz ko_13_5_precalculated.tab.gz /Volumes/MacOS/Miniconda3/envs/picrust1/lib/python2.7/site-packages/picrust/data  #激活環境  conda  activte picrust1

2.軟體使用

#按拷貝數標準化OTU表  normalize_by_copy_number.py -i closed-ref-otu/feature-table.biom -o normalized_otus.biom  #預測宏基因組  predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom  # 轉換格式為txt  biom convert -i metagenome_predictions.biom -o metagenome_predictions.txt --table-type="OTU table" --to-tsv  #調整為標準表格  #sed -i '/# Const/d;s/#OTU //g' metagenome_predictions.txt 我是黑蘋果，可能mac sed命令有所差別，沒有#完成這個命令。  #按功能級別分類匯總，-c指輸出類型，有KEGG_Pathways, COG_Category，RFAM三種，-l是級別，分3級  categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 3 -o metagenome_predictions.L3.biom  # 轉換格式為txt，然後就可以看結果了，使用excel打開即可清楚查看。  biom convert -i metagenome_predictions.L3.biom -o metagenome_predictions.L3.txt --table-type="OTU table" --to-tsv  #同樣沒有完成 sed -i '/# Const/d;s/#OTU //g' metagenome_predictions.L3.txt

3.看看結果

這就是美美的結果了，和宏基因組一樣可以做許多額外分析了。

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