分析糞便微生物移植後患者高通量單分子實時測序數據的工作流程

有許多基於測序的方法來了解複雜宏基因組，從全樣本鳥槍法測序到靶向擴增。雖然靶向方法在低測序深度提供有價值的數據，但它們受引物設計和PCR限制。全樣本鳥槍法通常使用短讀長測序，這導致數據處理困難。例如，長度小於500bp的讀數很少覆蓋完整的感興趣的基因或區域，所以將需要組裝。這不僅引入了來自不同社區成員的序列不正確地拼接的可能性，還需要高覆蓋深度。因此，罕見的社區成員可能不會在結果集合中被表示。、

循環共識，單分子實時（SMRT）測序讀長在1-3 kb範圍內，精度可達99％以上，可以使用上一代PacBio RS II產生，或者在更高的通量下，使用新的Sequel系統。儘管與短讀取測序方法相比，吞吐量較低，但讀長是社區的真實隨機抽樣，因為SMRT測序已被證明具有非常低的序列偏好。單分子讀數> 1kb，> 99％的共有準確度，可以合理地利用高比例的reads包括可用於分析的基因或基因片段，而無需重新組裝。

在這裡，我們介紹了在進行糞便微生物群移植（FMT）之前和之後，為了治療慢性艱難梭菌感染的個體微生物群的循環共識測序的結果。我們顯示即使具有相對較低的測序深度，長讀長，無裝配，隨機抽樣也可以讓我們在物種層面描述低丰度的社區成員。我們還顯示，使用長讀長的鳥槍測序，由於整個基因被單一reads覆蓋，所以可以實現使用經典的目標16S或短讀長測序技術無法實現功能性的預測。

長讀宏基因組分析工作流程

A)平均長度約2 kb的剪切基因組DNA在PacBio系統上製備並測序。多重測序通過SMRTbell模板進行，允許生成高品質的循環共識序列（CCS）讀數。

B)Prodigal（原核動態規劃Genefinding演算法）1，用於預測共有序列中的基因，並計算氨基酸序列。 blastp用於將推定的蛋白質序列與RefSeq細菌蛋白質資料庫進行比對。

C)blastn用於將準確的CCS讀數與RefSeq基因組資料庫比對0。

D)來自任一方法的Blast結果被導入到MEGAN2中，並且使用最低通用祖先（LCA）演算法為每個序列分配分類

來自在PacBio RS II或Sequel系統上測序的多個FMT微生物組分樣品的吞吐量。

前後FMT樣品在上一代PacBio RS II系統下進行測序，是本海報進一步討論的樣品。樣品FMT 3,5和6是相似的，但不同的FMT樣品運行在較高的吞吐量Sequel系統上進行比較。請注意，統計數據不僅受到排序系統的影響，也受文庫品質的影響。 測序文庫的較大尺寸分布將產生更多的預測基因。 新的Sequel系統和大小分布約2 kb的文庫可以產生> 40萬個基因，其中> 25萬個全長，如Prodigal。

FMT - 分類概況

來自慢性艱難梭菌感染個體的FMT前後樣本的分類學特徵。

與Microarray和16S分析數據進行類級別比較。 CCS方法在單個個體上證明，公布的微陣列和16S數據涵蓋不同時間點的多個個體。

（B）FMT前後的高解析度比較。 長讀長高精度的讀數允許在物種上進行分析，在某些情況下在菌株水平。

（C）實施blast針對核苷酸和氨基酸檢索。 在這種情況下，核苷酸分類具有更多的功能，因為蛋白質序列在不同物種之間是保守的。

FMT - KEGG功能分析

圖3. 長讀長高精度讀取的基因預測可以鑒定功能蛋白

每個小組顯示KEGG途徑和FMT前後樣品中發現的同源蛋白的頻率。

（A）TCA途徑中酶的頻率在兩個樣品之間是一致的。

（B）與鞭毛組裝相關的蛋白質特異於Pre-FMT樣品。

（C）Pre-FMT樣品中富集了細菌分泌系統，II型和VI型分泌途徑，而在兩個樣品中都發現了一般的Sec-SRP。

結論

使用單分子CCS讀數的長讀宏基因組分析提供了獨特的數據類型，與16S和霰彈槍裝配方法相比具有明顯的優勢。雖然對輸入量低和片段化DNA等樣品輸入問題具有高度的耐受性，但長讀宏基因組分析允許物種級別，在某些情況下允許菌株級分類學分類和功能研究。Sequel系統的這種實驗的通量使得單次測序運行可以產生來自宏基因組學社區的145,000個全長基因。對於FMT前和後FMT微生物組樣本，我們顯示與16S和微陣列數據相當的結果，同時允許更詳細，物種級分類和功能洞察。

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