chip_seq品質評估之查看抗體富集效果

• 2019 年 12 月 19 日
• 筆記

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chip_seq通過抗體來富集基因組上的部分區域，抗體富集的效果直接絕對了實驗的成敗, 藉助deeptools中的plotFringerprint命令，可以有效評估和查看抗體富集效果。

其核心原理就是累計分布函數，首先將基因組區域劃分成等長的區間也稱之為bin, 計算每個區間內coverage的比例，然後按照比例大小從第到高排序，依次將不同bin的coverage進行累加，繪製累計分布曲線。

對於input樣本，理論上來講reads在基因組上均勻分布的，不存在任何區域的富集，所以其累計分布曲線如下所示

上圖代表一個在-1到1之間的均勻分布，左側是其分布曲線，右側是累計分布曲線，可以看到是一條對角線。

對於抗體處理的樣本，由於只富集到基因組部分區域，所以其reads肯定不是均勻分布，累計分布曲線肯定是偏離對角線的。那麼一個好的抗體處理結果應該是什麼樣子呢，在deeptools的官網上給了示例

上圖是一個H3K4me3組蛋白修飾的chip_seq結果，對於input樣本，其累計分布曲線接近於對角線，之所以存在一定程度的偏離，是因為文庫構建過程中並不是完全隨機的，所以input樣本也存在了一些富集區域，這些區域就是peak caling過程中的背景；還有一個注意的是，橫坐標的起始位置部位0，這代表了基因組的覆蓋度，理論上來講應該是100%的覆蓋度，就是基因組所有區域都能檢測到對應的reads,但是在實際情況中，會存在部分區域檢測不到的情況，藉助橫坐標的起始位置可以判斷出基因組的覆蓋度。

對於抗體處理的樣本，由於其在基因組上部分區域富集，只需要富集區域對應的少數幾個bin累加佔比就特別高，在這種fingerprint圖上橫坐標越大對應bin富集的reads越多,而縱坐標代表累加的reads所佔比例。以上圖為例，黑色點對應的橫坐標為0.97， 縱坐標為0.55， 這說明97%的基因組區域對應的reads佔比只有55%， 剩下的3%區域的reads佔比高達45%, 這些3%的區域就可以看到富集的區域，所以上圖中抗體的富集效果是顯著的。

一個富集效果不顯著的例子如下

input和抗體處理的樣本累計分布曲線的趨勢接近，在抗體處理樣本的累計分布曲線中並沒有觀測到一個突出來的點。具體用法示意如下

plotFingerprint   -b testFiles/*bam   --labels H3K27me3 H3K4me1 H3K4me3 H3K9me3 input   --minMappingQuality 30   --skipZeros   --region 19   --numberOfSamples 50000   -T "Fingerprints of different samples"    --plotFile fingerprints.png   --outRawCounts fingerprints.tab

輸入文件為比對參考基因組產生的bam文件，輸出結果示意如下

突出的點越靠近右下方，說明基因組上富集區域的佔比越小。通過這種fingerprint圖，不僅可以對抗體富集效果有一個相對直觀的評估，還可以看出為覆蓋到的基因組比例以及富集區域的比例。

·end·

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