Highly Efficient Analysis of Glycoprotein Sialylation in Human Serum by Simultaneous Quantification of Glycosites and Site-Specific Glycoforms (通過同時定量糖基化位點和位點特異性糖型來高效分析人血清中的糖蛋白唾液酸化)-閱讀人：陳秋實
- 2019 年 10 月 3 日
- 筆記
期刊名：Journal of Proteome Research
發表時間：(2019年9月)
IF：3.78
單位：
- 中國科學院大連化學物理研究所
- 中國科學院大學
- 大連醫科大學第二附屬醫院
物種：人血漿
技術：用組氨酸修飾的具有可變換表面電荷的親水性智慧材料(組氨酸鍵合的二氧化硅，HBS)可選擇性地從複雜的生物樣品中富集唾液酸化的糖肽(SGP)
一、 概述：
糖蛋白的異常唾液酸化與許多惡性疾病密切相關，唾液酸化的分析對於揭示這些疾病的現狀具有很大的潛力。然而，深入分析唾液酸化仍然具有挑戰性，因為蛋白質糖基化具有高的微觀異質性而且唾液酸化糖肽的丰度低。在這裡，通過使用唾液酸化糖肽富集為糖蛋白唾液酸化在糖基化位點和特異位點上的糖型方面的詳細表徵制定了一個綜合方法。該方法在6微升血清中可以識別多達380個糖基化位點以及對應於383個位點特異性糖型的414個完整糖肽，這表明該糖蛋白唾液酸化詳細分析方法的靈敏度高。這個方法被進一步用於肝細胞癌患者與對照樣本糖蛋白唾液酸化的差異分析，同時得到344個糖基化位點和405個特異性位點糖型的定量結果。結果顯示43個糖基化位點和55種位點特異性糖型分別在位點水平和位點特異性糖型水平上發生顯著變化。有趣的是，同一糖基化位點上的一些糖型被發現有不同的變化趨勢。該方法被證明是一種強大的可以揭示糖蛋白唾液酸化的宏觀和微觀異質性微妙差異的工具。
二、 研究背景：
唾液酸化作為一種特定形式的糖基化，在調節蛋白之間的相互作用中扮演著重要角色，唾液酸化的異常與免疫疾病、耐藥性、腫瘤侵襲和諸如此類的疾病緊密相關。因此，評估和比較癌症病人和健康人中唾液酸化的變化具有重要意義。據報道糖結構唾液酸化的增加似乎在癌症發展的糖組學分析和糖基化位點佔有率中具有指示作用。眾所周知，糖基化修飾可以在多個糖基位化位點上發生，另外，不同的唾液酸化的糖可以連接到相同的位點，這就是唾液酸化的宏觀和微觀異質性。不幸的是，大多數專註於糖結構或糖基化位點的分析研究只能揭示不同糖基化位點上的糖的平均結果和所有糖型的糖基化位點的佔有率，而唾液酸化細節上的異質資訊在此過程中就丟失了。
血清樣品或細胞裂解液的消化液中含有的完整唾液酸化糖肽包含的資訊有：糖結構，肽段序列和糖基化位點，這些能讓我們確定特定位置的唾液酸化糖型。因為完整的唾液酸化糖肽與大量的非糖肽共存，所以很難在複雜的蛋白混合消化物中檢測到完整的唾液酸化糖肽，因此需要在蛋白消化物中對它們進行特異性富集。通過利用唾液酸的選擇性氧化，肼化學已被廣泛用於N連接或者O連接完整唾液酸化糖肽的高特異性富集。但是，唾液酸化的資訊會在氧化過程中丟失。因此，它不適用於分析完整唾液酸化糖肽。二氧化鈦色譜法可富集完整唾液酸化糖肽且不會破壞唾液酸結構。然而，這種方法有特異性和效率方面的缺點。在我們最近的工作中，一種具有可轉換表面電荷的親水性智慧材料（組氨酸鍵合的二氧化硅)被報道可以從複合生物樣本中選擇性富集完整唾液酸化糖肽。這種富集方法是基於完整唾液酸化糖肽的高親水性和負電荷性，並且糖肽的完整性在富集過程中可以得到保持，這適用於糖基化位點和位點特異性糖型的同時分析。
除了完整唾液酸化糖肽的富集，通過質譜技術來鑒定完整糖肽特異性位點糖型的唾液酸化分析也很困難。我們的實驗室發展了一種基於配對圖譜的方法，這種配對是通過合併糖肽和該糖肽去糖基化後的圖譜實現的。這兩種圖譜通過保留時間差和品質偏差匹配，這種方法可以提高完整糖肽的鑒定效率。然而，唾液酸可能會增加完整糖肽在長梯度液相色譜-串聯質譜中的保留時間，這會導致測定完整唾液酸化糖肽的高假陽性發現率。到目前為止，其他策略，例如pGlyco2.0和SugarQb都開發來鑒定完整糖肽。其中，據報道pGlyco2.0在識別完整糖肽上表現良好，它不依賴於糖肽保留時間，因此增加的唾液酸保留時間對完整唾液酸化糖肽的假陽性發現率沒有影響。因此，pGlyco2.0是在位點特異性糖型水平上分析糖蛋白唾液酸化的理想選擇。如上所述，對糖位點和特定部位糖型的詳細分析,可以為人類癌症的早期診斷提供潛在的生物標記物，以及增強生物標誌物的特異性和敏感性。在這項研究中，我們通過利用具有特異性和高效率特徵的完整唾液酸化糖肽富集方法，提出了一個能同時分析糖基化位點和位點特異性糖型的整合的工作流程。
三、 實驗設計：
四、研究成果：
1、液質聯用對去糖基化糖肽的兩次重複分析結果顯示在189個糖蛋白中鑒定到380個N連接糖基化位點。每次重複分析僅用到1.5微升的血清樣品。為了進一步確定完整的唾液酸化糖肽，pGlyco2.0軟體被用來分析完整糖肽的MS二級圖譜。結果顯示，兩次重複分析中鑒定到405個完整的糖肽和383個位點特異性糖型。另外，發現幾乎99％（378/383）的位點特異性糖型含有末端唾液酸，前十大高丰度的糖都被唾液酸化修飾。
圖 1. 100個正常人血清樣本池中唾液酸化的N連接糖基化位點(A)和位點特異性糖型(B)的鑒定；完整糖肽中鑒定出的前10種高丰度糖型的分布(C)
2、在正常人（對照）和肝細胞癌患者的血清中，共分別鑒定到434和389個糖基化位點。這其中來源於39個糖蛋白的43個糖基化位點有顯著的唾液酸修飾變化。在肝細胞癌患者的血清樣本中，它們中的18個糖基化位點明顯增加，25個糖基化位點明顯減少。對正常人和肝細胞癌患者血清的三次分析中共分別鑒定471和365個位點特異性糖型（1.5μL/次，3次總計4.5μL），同時在正常人和肝細胞癌患者血清的三次分析中共發現434和389個N連接的糖基化位點。
表格 1. 肝細胞癌患者和正常人血清中變化顯著的唾液酸化的糖基化位點數量
圖 2. 從對照（A）和肝細胞癌患者(B)血清中鑒定出N連接糖基化位點（三次分析），三次分析對照（C）和肝細胞癌患者(D)血清中共有的唾液酸化位點特異性糖型
3、在兩組樣品中（肝細胞癌患者和正常人血清），一共定量了405個位點特異性糖型。這其中，14個糖基化位點上的19個經過唾液酸修飾的糖型在肝細胞癌患者血清中顯著增加，33個糖基化位點上的36個經過唾液酸修飾的糖型在肝細胞癌患者血清中顯著減少。另外，有一些糖基化位點上的糖型既增加又減少。例如，觸珠蛋白相關蛋白第126位天冬醯胺上連接的糖型己糖（5）N-乙醯己糖胺（4）唾液酸（1）岩藻糖（3）在肝細胞癌患者血清中就增加了，而在相同位點的另一糖型己糖（7）N-乙醯己糖胺（5）唾液酸（2）岩藻糖（2）在該樣品中就降低了。
表格 2. 肝細胞癌患者和正常人血清中變化顯著的唾液酸化的位點特異性糖型數量
圖 3. 肝細胞癌患者和正常人血清中連接在觸珠蛋白相關蛋白第126位天冬醯胺上糖的變化趨勢（A），相同糖型在不同蛋白不同位點上的變化趨勢（B）（紅色表示在肝細胞癌患者血清中增加，綠色表示在肝細胞癌患者血清中降低，黑色表示無顯著變化，數字表示糖基化位點的位置）
五、文章亮點（結論討論）：
總之，我們提出了一種在糖基化位點和位點特異性糖型水平上分析唾液酸化的綜合策略，它可以同時繪製出糖蛋白唾液酸化的宏觀和微觀異質性。通過這一策略，總共從人血清樣本中759個完整糖肽中鑒定到714個位點特異性糖型。我們觀察到一些糖基化位點在相對位點佔有率和位點特異性糖型水平上具有不同的變化趨勢。這個平台已被證明是深入分析人血清糖基化宏觀和微觀異質性的強大工具。因此，它在篩選人類早期癌症診斷新型生物標誌物方面具有巨大的潛力。
閱讀人：陳秋實