腫瘤基因檢測與臨床

2019 年 11 月 9 日
筆記

隨著生物技術在醫學領域的快速發展和人們在細胞分子水平對腫瘤發病機制認識的深入，腫瘤治療逐漸從前基因組的細胞毒性藥物治療時代過渡到後基因組的靶向治療新時代。提到基因檢測，前幾年，臨床醫生在向患者推薦時還心存疑慮，而近兩年，基因檢測已成為癌症診療的標準動作，基本上每一個癌症患者都有一套自己的基因檢測報告。不得不說，一個患者一套方案的個體化診療時代已經到來。比如，一位患者患了癌症，不僅要做病理診斷還要做全基因檢測，發現突變位點，進而為患者制定包括化療，靶向，免疫治療方案，以及家族癌症風險評估。

癌症基因檢測到底是怎麼一回事，很多人只是聽說，但是對此知之甚少，今天我們就來理一理這裡面的很多概念和知識。

腫瘤相關基因突變

腫瘤之所以會發生，歸根結底是由於身體內累積了許多基因突變，導致基因功能發生改變，最終導致了癌症的發生。癌細胞中可能發生許多類型的基因改變。主要類型包括：

鹼基替換；

插入或缺失；

拷貝數變異；

重排（融合）；

什麼是癌症基因檢測

我們都知道，癌症是一種具有遺傳傾向的疾病，跟基因突變有著千絲萬縷的聯繫，而這些基因在某些程度上，也決定了癌細胞的生長與分裂。這時候通過對腫瘤的基因圖譜進行測試，從而確定到底是發生了哪些突變，而這個過程就叫做基因檢測。

腫瘤基因測試範圍從簡單到複雜。最簡單的測試只檢測一種基因中的一種類型的突變。比如僅在BRAF位置c.1799處尋找特定T到A置換突變的試驗。

相反，最複雜的測試可以同時檢測所有主要類型的基因改變，包括替換，重複，插入，缺失，插入，基因拷貝數變異和結構變體，包括倒位和易位。

基於基因檢測的精準治療

在惡性腫瘤的治療中，一個令人困惑的問題就是：同一分期、同一病理類型的惡性腫瘤患者，採用相同的治療方案，其療效（如生存期）為什麼會存在明顯差異？

隨著人類基因組計劃的完成，我們發現同一類型腫瘤的細胞分子生物學差異可能是導致疾病個體化差異的原因所在，繼而發現了一些與腫瘤發生密切相關的基因，即腫瘤的「驅動基因」。肺癌已知的驅動基因包括EGFR、ALK、KRAS、HER2、BRAF、PIK3CA、AKTI、MEKI、NRAS和MET。驅動基因不同，患者對腫瘤的治療反應也就不同，這就是相同分型、分期的腫瘤患者存在療效差異的原因。

目前一些藥物如靶向藥物具有特異性針對某種腫瘤基因突變達到精準殺傷的效果，而不同腫瘤患者腫瘤驅動基因突變存在差異，因此通過基因檢測，了解患者哪種基因發生突變，適合應用哪種藥物，也就達到了「量體裁衣」的效果，做到了「精準醫療」。

在實際的治療過程中，基因檢測可以幫助醫生制定最佳的治療方案。比如：一些人患肺癌後，可以利用基因檢測的手段對癌細胞中的EGFR進行檢測，一旦發現了該突變，就可以利用對應的靶向葯進行治療。再比如，有一些非常難以確診的腫瘤，需要依靠特定的基因改變協助確診。比如，如果基因檢測發現有ASPL-TFE3融合基因，那診斷腺泡軟組織肉瘤，就八九不離十了。

利用各種方法，把這些變異的基因找出來，仔細分析，可以協助臨床診斷、指導治療選擇、輔助監測疾病複發和耐葯、預估生存期等。

不同基因檢測方法比較

基因檢測的技術其實很多，目前大概有13類基因檢測技術，他們之間優劣勢對比如下。

1、等位基因特異性PCR

優點：敏感性 - 需要突變存在1-5％。無需特殊設備。

缺點：目標特異性，無法檢測到可能存在於腫瘤DNA中的其他突變。

2、Sanger雙脫氧測序

優點：可以檢測到各種未知的突變。如果首次從樣本中提取融合轉錄物的RNA，可用於檢測基因融合。無需特殊設備。

缺點：勞動強度大，需要突變DNA存在20-25％。無法檢測到外顯子或基因拷貝數的變化。

3、焦磷酸測序

優點：快速和靈敏地檢測5％水平的突變DNA。

缺點：需要焦磷酸測序儀器; 在可以在腫瘤DNA中檢測到的突變類型方面受到限制。

4、質譜法

優點：靈敏，存在5-10％可靠地檢測突變DNA; 測試多個基因。

缺點：需要質譜儀器; SNV特異性並且不能檢測可能存在的腫瘤DNA中的其他突變。

5、單鹼基擴展測定

優點：靈敏，可靠地檢測突變DNA，如果以5-10％存在; 測試多個基因。無需特殊設備。

缺點：SNV特異性並且不能檢測可能存在於腫瘤DNA中的其他突變。

6、多重連接依賴性探針擴增 - MLPA

優點：快速且能夠同時檢測多個突變。無需特殊設備。可以檢測到10％的目標SNV。

缺點：對於外顯子或基因拷貝數變異檢測，需要突變DNA以20-40％的水平存在。靶向的SNV和外顯子和基因拷貝數變體都是特異性的，並且不能檢測到腫瘤DNA中的其他突變。試劑盒可能不適用於感興趣的基因或突變。新鮮冰凍組織檢測效果優於石蠟包埋組織提取DNA。

7、熒光原位雜交 - FISH

優點：輕鬆檢測基因拷貝數變化和有針對性的SV，這些SV不易被其他方法檢測到; 基於細胞的成像可以檢測一小部分細胞中的事件。

缺點：需要石蠟包埋組織未染色的切片; 無法檢測到實體瘤腫瘤中發生的大多數突變類型。

8、新一代測序-擴增捕獲

優點：能夠同時檢測單個鹼基替換以及更複雜的突變，包括單次測定中許多基因中的重複，插入，缺失和插入缺失; 需要少量的DNA。當測序到高「覆蓋深度」（1000x覆蓋率）時，測定對於檢測低丰度突變是敏感的。

缺點：昂貴; 需要一種完全不同於其他分子檢測方法的DNA製備方法。無法檢測基因拷貝數變化和SV。

9、新一代測序 - 雜交捕獲

優點：能夠同時檢測單個測定中許多基因中的替換，重複，插入，缺失，插入和外顯子和基因拷貝數變化。探針也可以設計為捕獲經常重新排列的基因中的選擇性易位斷點，如FoundationOne TM。

缺點：昂貴; 需要與傳統上用於其他分子突變測定的完全不同的DNA製備方法; 需要更多的腫瘤組織; 需要複雜的生物資訊學。

10、新一代測序 - 全外顯子組測序

優點：綜合性中等。在同一檢測中，可同時檢測許多基因中的替換，重複，插入，缺失，插入和外顯子和基因拷貝數變化。

缺點：昂貴; 需要完全不同於傳統上用於其他分子突變檢測技術的DNA製備方法; 需要更多的腫瘤組織; 需要複雜的生物資訊學。

11、新一代測序 - 全基因組測序

優點：最全面。可同時檢測整個基因組中的替換，重複，插入，缺失，插入，基因和外顯子拷貝數變化以及染色體反轉和易位。

缺點：昂貴和低產量; 需要完全不同於傳統上用於大多數突變檢測技術的DNA製備方法; 需要更多的腫瘤組織; 需要複雜的生物資訊學; 對數據存儲和處理有巨大的計算需求。

12、數字PCR - ddPCR

優點：高水平的敏感性和特異性; 相對便宜。

缺點：只能檢測已知的有針對性的突變 ; 受限於檢測到的突變類型; 每個測定只能檢測到有限數量的突變。

13、BEAMing技術

優點：高度的敏感性和特異性

缺點：只能檢測已知的有針對性的突變 ; 受限於檢測到的突變類型; 每個測定只能檢測到有限數量的突變。

結語

看了上面的介紹，是不是對常用的腫瘤基因檢測有了全面的了解來呢？是不是也感受到了基因檢測的複雜性？當然了，雖然目前有很多種檢測方法，但是目前用的最多的還是二代測序技術，而且隨著國家FDA對二代測序的試劑盒和測序儀的政策審批放開，以後通過二代測序檢測腫瘤基因會擁有更大的應用場景。這個裡面大數據分析可謂關鍵性的技術問題，所以，學好數據分析，以後到哪都是「香餑餑」。

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