肿瘤基因检测与临床

2019 年 11 月 9 日
筆記

随着生物技术在医学领域的快速发展和人们在细胞分子水平对肿瘤发病机制认识的深入，肿瘤治疗逐渐从前基因组的细胞毒性药物治疗时代过渡到后基因组的靶向治疗新时代。提到基因检测，前几年，临床医生在向患者推荐时还心存疑虑，而近两年，基因检测已成为癌症诊疗的标准动作，基本上每一个癌症患者都有一套自己的基因检测报告。不得不说，一个患者一套方案的个体化诊疗时代已经到来。比如，一位患者患了癌症，不仅要做病理诊断还要做全基因检测，发现突变位点，进而为患者制定包括化疗，靶向，免疫治疗方案，以及家族癌症风险评估。

癌症基因检测到底是怎么一回事，很多人只是听说，但是对此知之甚少，今天我们就来理一理这里面的很多概念和知识。

肿瘤相关基因突变

肿瘤之所以会发生，归根结底是由于身体内累积了许多基因突变，导致基因功能发生改变，最终导致了癌症的发生。癌细胞中可能发生许多类型的基因改变。主要类型包括：

碱基替换；

插入或缺失；

拷贝数变异；

重排（融合）；

什么是癌症基因检测

我们都知道，癌症是一种具有遗传倾向的疾病，跟基因突变有着千丝万缕的联系，而这些基因在某些程度上，也决定了癌细胞的生长与分裂。这时候通过对肿瘤的基因图谱进行测试，从而确定到底是发生了哪些突变，而这个过程就叫做基因检测。

肿瘤基因测试范围从简单到复杂。最简单的测试只检测一种基因中的一种类型的突变。比如仅在BRAF位置c.1799处寻找特定T到A置换突变的试验。

相反，最复杂的测试可以同时检测所有主要类型的基因改变，包括替换，重复，插入，缺失，插入，基因拷贝数变异和结构变体，包括倒位和易位。

基于基因检测的精准治疗

在恶性肿瘤的治疗中，一个令人困惑的问题就是：同一分期、同一病理类型的恶性肿瘤患者，采用相同的治疗方案，其疗效（如生存期）为什么会存在明显差异？

随着人类基因组计划的完成，我们发现同一类型肿瘤的细胞分子生物学差异可能是导致疾病个体化差异的原因所在，继而发现了一些与肿瘤发生密切相关的基因，即肿瘤的“驱动基因”。肺癌已知的驱动基因包括EGFR、ALK、KRAS、HER2、BRAF、PIK3CA、AKTI、MEKI、NRAS和MET。驱动基因不同，患者对肿瘤的治疗反应也就不同，这就是相同分型、分期的肿瘤患者存在疗效差异的原因。

目前一些药物如靶向药物具有特异性针对某种肿瘤基因突变达到精准杀伤的效果，而不同肿瘤患者肿瘤驱动基因突变存在差异，因此通过基因检测，了解患者哪种基因发生突变，适合应用哪种药物，也就达到了“量体裁衣”的效果，做到了“精准医疗”。

在实际的治疗过程中，基因检测可以帮助医生制定最佳的治疗方案。比如：一些人患肺癌后，可以利用基因检测的手段对癌细胞中的EGFR进行检测，一旦发现了该突变，就可以利用对应的靶向药进行治疗。再比如，有一些非常难以确诊的肿瘤，需要依靠特定的基因改变协助确诊。比如，如果基因检测发现有ASPL-TFE3融合基因，那诊断腺泡软组织肉瘤，就八九不离十了。

利用各种方法，把这些变异的基因找出来，仔细分析，可以协助临床诊断、指导治疗选择、辅助监测疾病复发和耐药、预估生存期等。

不同基因检测方法比较

基因检测的技术其实很多，目前大概有13类基因检测技术，他们之间优劣势对比如下。

1、等位基因特异性PCR

优点：敏感性 – 需要突变存在1-5％。无需特殊设备。

缺点：目标特异性，无法检测到可能存在于肿瘤DNA中的其他突变。

2、Sanger双脱氧测序

优点：可以检测到各种未知的突变。如果首次从样本中提取融合转录物的RNA，可用于检测基因融合。无需特殊设备。

缺点：劳动强度大，需要突变DNA存在20-25％。无法检测到外显子或基因拷贝数的变化。

3、焦磷酸测序

优点：快速和灵敏地检测5％水平的突变DNA。

缺点：需要焦磷酸测序仪器; 在可以在肿瘤DNA中检测到的突变类型方面受到限制。

4、质谱法

优点：灵敏，存在5-10％可靠地检测突变DNA; 测试多个基因。

缺点：需要质谱仪器; SNV特异性并且不能检测可能存在的肿瘤DNA中的其他突变。

5、单碱基扩展测定

优点：灵敏，可靠地检测突变DNA，如果以5-10％存在; 测试多个基因。无需特殊设备。

缺点：SNV特异性并且不能检测可能存在于肿瘤DNA中的其他突变。

6、多重连接依赖性探针扩增 – MLPA

优点：快速且能够同时检测多个突变。无需特殊设备。可以检测到10％的目标SNV。

缺点：对于外显子或基因拷贝数变异检测，需要突变DNA以20-40％的水平存在。靶向的SNV和外显子和基因拷贝数变体都是特异性的，并且不能检测到肿瘤DNA中的其他突变。试剂盒可能不适用于感兴趣的基因或突变。新鲜冰冻组织检测效果优于石蜡包埋组织提取DNA。

7、荧光原位杂交 – FISH

优点：轻松检测基因拷贝数变化和有针对性的SV，这些SV不易被其他方法检测到; 基于细胞的成像可以检测一小部分细胞中的事件。

缺点：需要石蜡包埋组织未染色的切片; 无法检测到实体瘤肿瘤中发生的大多数突变类型。

8、新一代测序-扩增捕获

优点：能够同时检测单个碱基替换以及更复杂的突变，包括单次测定中许多基因中的重复，插入，缺失和插入缺失; 需要少量的DNA。当测序到高“覆盖深度”（1000x覆盖率）时，测定对于检测低丰度突变是敏感的。

缺点：昂贵; 需要一种完全不同于其他分子检测方法的DNA制备方法。无法检测基因拷贝数变化和SV。

9、新一代测序 – 杂交捕获

优点：能够同时检测单个测定中许多基因中的替换，重复，插入，缺失，插入和外显子和基因拷贝数变化。探针也可以设计为捕获经常重新排列的基因中的选择性易位断点，如FoundationOne TM。

缺点：昂贵; 需要与传统上用于其他分子突变测定的完全不同的DNA制备方法; 需要更多的肿瘤组织; 需要复杂的生物信息学。

10、新一代测序 – 全外显子组测序

优点：综合性中等。在同一检测中，可同时检测许多基因中的替换，重复，插入，缺失，插入和外显子和基因拷贝数变化。

缺点：昂贵; 需要完全不同于传统上用于其他分子突变检测技术的DNA制备方法; 需要更多的肿瘤组织; 需要复杂的生物信息学。

11、新一代测序 – 全基因组测序

优点：最全面。可同时检测整个基因组中的替换，重复，插入，缺失，插入，基因和外显子拷贝数变化以及染色体反转和易位。

缺点：昂贵和低产量; 需要完全不同于传统上用于大多数突变检测技术的DNA制备方法; 需要更多的肿瘤组织; 需要复杂的生物信息学; 对数据存储和处理有巨大的计算需求。

12、数字PCR – ddPCR

优点：高水平的敏感性和特异性; 相对便宜。

缺点：只能检测已知的有针对性的突变 ; 受限于检测到的突变类型; 每个测定只能检测到有限数量的突变。

13、BEAMing技术

优点：高度的敏感性和特异性

缺点：只能检测已知的有针对性的突变 ; 受限于检测到的突变类型; 每个测定只能检测到有限数量的突变。

结语

看了上面的介绍，是不是对常用的肿瘤基因检测有了全面的了解来呢？是不是也感受到了基因检测的复杂性？当然了，虽然目前有很多种检测方法，但是目前用的最多的还是二代测序技术，而且随着国家FDA对二代测序的试剂盒和测序仪的政策审批放开，以后通过二代测序检测肿瘤基因会拥有更大的应用场景。这个里面大数据分析可谓关键性的技术问题，所以，学好数据分析，以后到哪都是“香饽饽”。