Immunity：菌群研究里程碑，可有效篩選供者菌群

• 2019 年 10 月 6 日
• 筆記

文章思路：腸道微生物菌群的重要性→糞便移植手術對多種疾病治療的可行性→糞便移植手術治療炎症性腸病→如何有效篩選供者菌群→找到了一種判定的方法：菌群對T細胞亞群比例的影響與對炎症性腸病的治療效果相關

• 小鼠模型：
• 無菌小鼠腸道菌群移植→判定菌群對腸道T細胞亞群比例的影響
• 轉移性腸炎小鼠腸道菌群移植→判定菌群的治療效果
• 文章亮點：普通的腸道菌群測序無法區分健康人與患者菌群，腸道菌群對無菌小鼠Foxp3+ Treg頻率的影響也無法區分健康人與患者菌群，而菌群移植後無菌小鼠腸道中RORγt+ Treg/Th17的比例可以反映菌群的治療效果。

近年來，關於腸道微生物的研究越來越深入，這些居於我們體內的小小生物變得越發神乎其神起來。它們不僅幫助我們製造必需的維生素、消化吸收營養物質，參與病原體的識別與免疫應答，甚至能夠影響我們的飲食習慣、精神狀態乃至壽命長短。科學界普遍認為，腸道菌群參與炎症性腸病以及肥胖等代謝性疾病的發生。不良的腸道健康與肥胖、2型糖尿病、心臟病、炎症性腸病等都有密切關係。

健康的腸道菌群對於人體至關重要。當腸道中的微生物失調時，可能會引發多個系統的疾病。多年來，人們嘗試各種方法為腸炎的嚴重程度進行分級，並試圖提出各種各樣的治療方法，但均未取得重大突破。

除遺傳因素外，腸道菌群被認為是炎症性腸病（IBD）的另一主要誘因，但由於腸道菌群高度的複雜性和個體差異性，我們難以界定「失調」菌群，如果可以將複雜的微生物群清晰化分為「共生菌」與「失調菌」，就能更好地判斷微生物群-宿主穩態是否被打破，同時可進一步完善IBD患者糞便移植（FMT）的治療方案。

由於許多疾病與腸道微生物失調有關，很多科學家便想到，那改變患者腸道中的菌群種類是不是就能夠治療疾病呢？於是，糞便移植便出現了，糞便移植（FMT）是一種通過重建腸道菌群來治療疾病的方法。即把經過處理的健康人的糞便液，灌到患者腸道內，歷史上第一個有英文文字記載案例使1958年美國醫生用糞水挽救感染垂死的患者。

雖然聽起來糞便移植的原理很容易理解，但是，我們該如何選擇糞便移植的供者呢？顯而易見的是，不同的供者的糞便菌群是很不一樣的，哪些供者的糞便合適做移植呢？我們又該採取一個怎樣的方法來判斷呢？有沒有什麼合適的觀測手段呢？

針對該問題，本文作者Britton等，將炎症性腸炎患者和健康人的腸道菌群移植給無菌小鼠和結腸炎易感小鼠，並檢測了移植後腸道T細胞群的變化。結果表明，在向無菌（GF）小鼠移植菌群後，檢測組織中駐留的T細胞亞群可能是判定某菌群對炎症性腸炎（IBD）治療是否有效的判斷依據。

首先，我們來看一些背景知識：

• Th17是由細胞因子介導的炎性細胞，在結腸炎的炎性過程中發揮重要作用。Th17細胞分泌IL-17A、 IL-17F和IL6等細胞因子，轉錄因子孤獨受體γt（RORγt）是控制Th17分化的特異性轉錄因子。Th17即常說的促炎細胞。
• Treg：主要作用免疫負調節，抑制免疫系統對自身和外來抗原的應答，維持免疫耐受和免疫穩態。插頭翼狀旋轉轉錄因子（Foxp3）是調控Treg細胞的關鍵轉錄因子，是Treg細胞的特異性標誌。Treg細胞可以限制抗感染效應細胞的過度應答，即常說的抑炎細胞。

Britton等收集了健康人與兩組IBD患病人群的糞便標本/菌群。IBD樣本取自潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD）的活動期和緩解期。16S rRNA測序結果顯示，健康人與兩組IBD患者的菌群結構無顯著差異。

單純地分析菌群難以發現差異，作者又研究了GM小鼠對不同來源菌群的免疫反應。

將這些健康人和IBD菌群樣本定植入小鼠腸道，並評估黏膜免疫應答。結果顯示：來自IBD病人的菌群誘導產生Th17的能力更強。但雖然如此，兩種小鼠均不產生明顯的疾病表型。

除了效應T細胞（Th）分化外，腸道微生物定植被認為能夠使表達Foxp3+的調節性T細胞（Treg）亞群擴增。令人驚奇的是，Britton等發現，來自健康人和IBD患者的微生物群均能以相同方式擴大Foxp3+ Treg細胞，同時與RORγt+ 效應性T細胞頻率無相關性。因此，微生物定植所誘導的總的Foxp3+ Treg細胞數目並不能預測該微生物菌群是「健康的」還是「失調的」。

Foxp3+ Treg可來源於胸腺或自組織中的naïve T細胞原位分化。兩種來源的Treg細胞具有相同的表面標誌物。而Britton通過Foxp3與RORγt共表達及Ikaros家族成員Helios（lkzf2）缺失，使他們能夠區分一群僅在腸道共生菌定植後誘導的Treg亞群。

儘管存在一些變異，但來自健康人而非IBD病人的微生物組能夠在腸道固有層中誘導更高平均頻率的RORγt+ Treg細胞，無論是通過糞漿移植還是培養後的細菌移植。

這些發現表明，微生物組誘導的RORγt+ Treg細胞在結腸炎中起保護作用，還可以在菌群失調時提高胸腺來源的Treg細胞的比例（Foxp3+ Treg），這就解釋了為什麼不同菌群移植組總Foxp3+ Treg細胞數目無差異。

移植了 IBD患者菌群的小鼠，高表達共刺激受體的樹突狀細胞（DC細胞）能使誘導型Treg細胞數目降低。

接著，作者用小鼠結腸炎模型來進行驗證。

Rag-/-小鼠是T、B淋巴細胞均缺陷的常用免疫缺陷小鼠，在免疫原性菌群和體外輸注T細胞同時存在的情況下，才可誘導產生結腸炎疾病模型。

作者發現，移植IBD患者菌群的Rag缺陷小鼠表現出一系列腸炎疾病表徵，包括：體重降低、細胞浸潤組織等。且移植IBD糞便菌群的小鼠的結腸炎比移植健康供體菌群的小鼠更嚴重。

而且，作者還發現IBD菌群組誘導更多的Th17細胞和一群高度促炎的共表達IL-17和干擾素IFN-γ的T細胞亞群；只有很少的Foxp3+ Treg細胞被誘導產生，約一半共表達RORγt。但是，在這些情況下作者們並未發現健康受試者與IBD患者的差異。

最後，作者試圖了解CD4+T細胞反應的變化，我們觀察到在Rag TCT小鼠中，結腸炎的嚴重程度與GATA3+Th或Foxp3+Treg細胞無關。但B6小鼠結腸和迴腸RORgt+Th細胞的比例與同一菌群的RAGTCT小鼠結腸炎的嚴重程度呈正相關。這就說明B6小鼠中RORgt+Treg細胞的誘導數量與RagTCT小鼠結腸炎的嚴重程度呈負相關。

最後，Britton等通過邏輯模型研究了未造模無菌小鼠中輔助性T細胞應答的參數與疾病嚴重程度及人類微生物組供者的健康程度。結腸RORγt+Th細胞的比例具有合理的預測價值（AUC=0.71），但結腸RORγt+Treg細胞的比例則更具資訊性（AUC=0.92）。

T細胞移植後6周的結腸炎嚴重程度也可以高度預測供體的健康狀況（AUC=0.93）。我們發現，當在穩態條件下誘導的結腸RORγt+Treg細胞比例和第6周RagTCT小鼠結腸炎嚴重程度合併在邏輯模型中，預測能力最佳（AUC=0.95）。也就是說，相對Th細胞，RORγt+細胞的數量對於預測人類微生物組供者的健康程度是最有效果的。

因此，Britton等人的研究，不僅表明了IBD微生物群的跨物種可轉移性，同時也提出了一種評估複雜的人類微生物組結腸炎易感性的方法學——誘導性RORγt+ Treg細胞頻率。

這些結果也同之前的研究達成一致——RORγt+ Treg細胞在T細胞轉移結腸炎模型中有優越的抑制性；在Foxp3+ Treg中敲除RORγt可在不同的化學誘導結腸炎模型中增強疾病評分。此外，當給小鼠定植潛在致病菌——肝螺桿菌時，只要宿主能夠誘導產生抗原特異性的RORγt+ Treg細胞就不會導致腸道炎症。此研究進一步強化了RORγt+ Treg在微生物耐受中的重要性，同時為篩選糞便移植手術的潛在人類微生物組供者提供了可能。對理想微生物組供者的鑒定是當前實現IBD患者糞便移植手術的主要瓶頸之一。

該文全文總結如下圖所示——

來自IBD供體的與人類微生物群的異種定植於成年無菌小鼠，導致迴腸和結腸固有層中的RORγt+ Th17（和GATA3+ Th2）效應細胞頻率增強，並導致結腸炎易感小鼠的疾病嚴重性增強。

從健康和IBD供體收集的微生物群用一種相似的方式導致體外無菌小鼠腸道中Foxp3+Treg細胞總數增加。從健康人群採集的微生物組一般可在迴腸和結腸固有層誘導更高頻率的RORγt+ Foxp3+ Treg細胞產生，從而阻止疾病加劇。

這些結果無關於糞便樣品採集於潰瘍性結腸炎還是克羅恩病患者，也無關於疾病處於恢復期還是活躍期。微生物定植後，小鼠腸道RORγt+Foxp3+ Treg細胞及Th17細胞的頻率對人類微生物供體的疾病狀況有良好的預測性。

在未來的研究中，小鼠與人類RORγt+ Treg細胞誘導的調節機制將會成為熱點。同時，對RORγt+ Treg細胞產生及功能存在潛在影響的遺傳易感基因位點的發現將有助於我們對於IBD病理生理學的理解。

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