Nature：有史以來「最逼真」糖尿病血管病變模型的建立

• 2019 年 10 月 6 日
• 筆記

文章詳情：科研貓 糖尿病影響著全球數億人的健康，其可引發多種嚴重併發症，如失明、腎衰竭、心臟病發作、中風和截肢，究其原因是血管病變所致，如血管基底膜的擴張和血管細胞的丟失。糖尿病還會損害內皮細胞的功能，擾亂內皮細胞與周皮細胞的通訊。

該研究報道了通過誘導多能幹細胞自發形成的三維人血管類似物。該類血管模型包含內皮細胞和周細胞，它們可以自發組裝成毛細血管網路，並由基底膜包裹。移植到小鼠體內的類血管可在動脈、小動脈和靜脈形成穩定的灌注血管樹。

體外實驗證明，該類血管暴露於高血糖和炎症細胞因子時，其血管基底膜會增厚。在小鼠體內實驗中，暴露於糖尿病環境中的類血管，也可模擬糖尿病患者的微血管變化。該研究證實NOTCH3及其配體DLL4是糖尿病人血管病變的關鍵驅動因子。因此，來自人類幹細胞的類血管模型成功地再現了人類血管的結構和功能，是可以真實模擬糖尿病血管病變的系統。

* 周細胞嵌入毛細血管內皮細胞的基膜中，通過物理接觸和旁分泌訊號與內皮細胞進行細胞通訊，監視和穩定內皮細胞的成熟過程。

傳統建模：共培養技術– iPS（誘導型多能幹細胞）來源的內皮細胞+周細胞/早期血管細胞–建立血管網路

該模型：多步驟自發形成的三維類血管模型

類血管模型的體外驗證

1）電鏡證實了管腔、基底膜和內皮細胞之間存在典型的緊密連接

2）血管內皮尖端細胞的CD31+絲狀偽足提示新生血管的形成（共聚焦技術）

3）基因表達譜分析證實內皮細胞、周細胞功能的成熟。

類血管模型的體內驗證

1）體外建模，移植入NSG小鼠（免疫缺陷）腎被膜下（存活期6個月以上）

2）熒光抗體（抗CD31）灌注顯示：人血管與小鼠血管功能連接正常

3）組織學切片分析顯示移植物細胞在體內分化為動脈、小動脈、毛細血管和靜脈

4）血管模型的經基因編輯用熒光蛋白基因標記（BFP&RFP），分析顯示在小鼠體內成功建立了人源性的血管樹

類血管（高糖誘導）vs糖尿病人血管 體外實驗

1）T2D患者：真皮微血管增厚、洋蔥皮樣分層，基底膜分裂；炎癥狀態，TNF和IL-6水平升高

2）高糖誘導類血管模型後：IV型膠原增厚、TNF和IL-6升高、周細胞細胞外基質合成增加、血管增厚和基底膜分層（電鏡）

3）傳統共培養模型未發現IV型膠原的合成增加

4）糖尿病血管模型的內皮細胞與周細胞比例降低，內皮細胞和周細胞的絕對數量減少

5）糖尿病病人內皮細胞（vs正常人）改變主要表現在膠原合成和胞外基質合成

鏈黴素誘導移植鼠產生糖尿病

體內實驗

1）體內試驗發現，糖尿病小鼠體內，人源血管的基底膜明顯增厚，而鼠源血管的基底膜無明顯變化。

2）此外，人源血管還顯示出其他糖尿病性血病變，如血管退化和內皮細胞丟失

糖尿病治療藥物對血管病變的療效

體外實驗

1）該研究的所有藥物對該類血管模型的基底膜增厚均無改善作用

2）阻斷與糖尿病血管併發症有關的訊號通路後，γ-分泌酶抑製劑DAPT可以明顯消除IV膠原的增厚、恢復內皮細胞的增殖

體內試驗

1) DAPT在體內對糖尿病小鼠血管基底膜的增厚有明顯的改善作用

2)DAPT可以補救血管滲漏

3)還可以挽救糖尿病小鼠CD31+內皮細胞的丟失

探究判斷DAPT作用靶點

1）糖尿病併發症與Notch通路密切相關

2）阻斷Notch配體發現，阻斷DLL4和NOTCH3可阻止血管基底膜增厚

3）使用CRISPR-Cas9生成DLL4和NOTCH3突變血管基底膜的擴張明顯減少

4）在移植小鼠類血管模型中，NOTCH3及其下游靶點HES5和HEY1主要在SMA+周細胞中表達，且糖尿病小鼠中HES5表達增加。

5）與移植的血管模型類似，在來自T2D患者和健康個體的真皮血管中，NOTCH3和HES5也主要表達於周細胞;在T2D患者的真皮毛細血管中，周細胞中HES5表達也是增加的。

結論：在體內阻斷NOTCH3通路可以緩解糖尿病小鼠血管基底膜的病變

綜上：

該研究報道了來自iPS細胞和胚胎幹細胞的自發形成的三維類人血管模型，它們具有人體微血管的形態、功能和分子特徵。動物活體灌注後形成的人血管模型中，類血管分化成小動脈、毛細血管和小靜脈，這一系統可用於模擬糖尿病微血管病變的結構和功能。

γ-分泌酶的作用靶點NOTCH3及其配體DLL4被確定為基底膜的增厚的關鍵媒介。體內試驗證明γ-分泌酶抑製劑以及NOTCH3抑製劑均可明顯減輕微血管疾病。內皮細胞和周細胞之間複雜的相互作用，是引發糖尿病血管基底膜增厚的重要原因。

該研究很重要的一點是，在移植物糖尿病小鼠和T2D患者中，在人血管的周細胞中均發現了Notch作用靶點HES5的表達增加，為糖尿病相關血管病變研究指明了方向。

該類血管的體內模型可用於識別糖尿病血管變化的相關通路，並開發減輕糖尿病微血管變化的藥物。