T cell infiltration in old neurogenic niches

• 2020 年 3 月 30 日
• 筆記

今天分享一篇2019年7月份發表在nature上的文章：《Single-cell analysis reveals T cell infiltration in old neurogenic niches》，有興趣的同學可以自行去pubmed上下載閱讀。

前言

提出問題：

人類是神經幹細胞也有幹細胞的niche。隨著年齡的增長，niche的功能逐漸減弱，但是這期間niche發生了什麼大家一直不清楚。

研究方法：

於是幾個科學家就對年輕和年老的小鼠腦細胞進行了單細胞測序，分析了14685個單細胞轉錄組數據。

結論：

1. 發現年老的niche中激活的神經幹細胞數目少，內皮細胞和小膠質細胞（可以看做是神經系統里的巨噬細胞）發生了改變，並且有T細胞的浸潤。
2. 腦中T細胞和年老小鼠外周血中的T細胞不同，說明在腦中可能存在一種特殊的抗原。
3. 年老的niche中的T細胞表達γ干擾素，而腦中對γ干擾素有很強反應的神經幹細胞增殖活性大大減低。

其實我想說的是，大家在看到提出的問題後，就可以先自行構思下，如果讓你解決這個問題，你會採取哪些做法？用什麼證據來說明問題？

我現在還沒開始看正文，所以我就先談一下我自己的想法：既然不同年齡段的神經niche發生了改變，那就肯定需要收集不同年齡段的腦組織細胞。既然做單細胞分析，那就需要確定具體的細胞類型，根據生物學背景常識知識，一般肯定是需要根據marker收集到具體的神經幹細胞，起到輔助作用的間質細胞，以及作用強大而意義不明的免疫細胞。通過單細胞測序技術，分析不同年齡下幹細胞發生了什麼改變，間質細胞又發生了什麼改變，以及免疫細胞出現了什麼變化。

當然了，我們的數據不單單是轉錄組的測序數據，我們也可以通過流式技術看一看某一類細胞的數目改變。例如：統計下不同年齡下幹細胞的數目變化，如果說年老的小鼠神經幹細胞數目明顯減低，那後續的研究分析過程中肯定要重點去找為什麼幹細胞數目減低了？以及去找哪些因素、細胞因子、其他細胞會對幹細胞起到影響作用。

我也只是隨便舉個例子，大家可以在閱讀文獻的時候多思考下，這樣自己的課題才會有更多的想法吧。

下面開始進入正文，讓我學習下作者是怎麼找證據來證明他的結論的。

背景知識

所有正文中可能需要用到的背景知識我都會補充在這裡，當然只是那些我覺得我不會的知識我才會去搜集，如果你不會，但是我沒有搜集，那麼就請大家自己去搜索資料吧。

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SVZ區

《成年腦神經發生機制的研究進展 》中提到：

在成年哺乳動物中， 神經發生通常在側腦室的室管膜下區-嗅球（SVZ-OB）和海馬齒狀回顆粒下區（SGZ）區，因而將這些區域認為是成年哺乳動物腦的「神經源性區域」 。

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星形膠質細胞

星形膠質細胞（Astroglia），是哺乳動物腦內分布最廣泛的一類細胞，也是膠質細胞中體積最大的一種。星形膠質細胞具有許多突起，伸展充填在神經細胞的胞體及其突起之間，起支援和分隔神經細胞的作用，並參與了血腦屏障的形成。

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少突膠質細胞

少突膠質細胞的主要功能是在中樞神經系統中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結構、協助生物電訊號的跳躍式高效傳遞並維持和保護神經元的正常功能。其異常不僅會導致中樞神經系統脫髓鞘病變，還會引起神經元損傷或精神類疾病，甚至可以引發腦腫瘤。

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SOX2

SOX2轉錄因子與DNA上的OCT4形成三聚體複合物，並控制許多參與胚胎髮育的基因的表達，例如YES1，FGF4，UTF1和ZFP206。對於早期胚胎髮生和胚胎幹細胞多能性至關重要。可能充當神經元發育的開關。下游SRRT靶標介導神經幹細胞自我更新的促進。通過抵消proneural蛋白的活性使神經細胞保持未分化狀態。

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CD31

CD31，又稱為血小板內皮細胞粘附分子，表達在血管內皮細胞表面，可以當做血管的標誌。

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巢式PCR

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物，結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短於第一次擴增。巢式PCR的好處在於，如果第一次擴增產生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對並擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。

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TCR的組成

TCR是由兩條不同肽鏈構成的異二聚體，由α、β兩條肽鏈組成。每條肽鏈又可分為可變區（V區），恆定區（C區），跨膜區和胞質區等幾部分。其抗原特異性存在於V區。

V區（Vα、Vβ）又各有三個高變區CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3變異最大，直接決定了TCR的抗原結合特異性。

一個T細胞表面有1種TCR，當某個可以和這種TCR結合的抗原存在時，這類T細胞在共刺激訊號的作用下會活化，活化的T細胞可以表現為大量擴增，形成一個克隆，同時功能也會活化。

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IFN- γ

《IFN- γ 研究進展與臨床應用 》中提到：

1. 干擾素是細胞被病毒感染時產生的一類細胞因子，調控感染後固有免疫和獲得性免疫反應。
2. 國際干擾素命名委員會按干擾素的抗原特異性將其分為 3型：IFN- α、IFN- β 和 IFN- γ，各型又因氨基酸序列的不同分為若干個亞型， IFN- γ 可能有 4 個亞型。IFN- α 和 IFN- β 屬於Ⅰ型干擾素，為病毒或人工合成的聚核苷酸誘導白細胞產生，IFN- γ 為特異性抗原（細菌、LPS） 、PHA 和卡介苗（BCG）等刺激T 細胞產生。
3. IFN-γ的來源：相比Ⅰ 型干擾素，能夠產生 IFN- γ 的細胞類型較少。

在獲得性免疫中，激活的 T 細胞（尤其是 CD8 +T 細胞）是 IFN- γ 的主要來源，而 NK 細胞和 NKT 細胞是固有免疫中產生 IFN- γ 的主要細胞類型。 干擾素誘導劑是一類作用於人體後，可以激活干擾素基因，促使細胞產生干擾素的物質的統稱。常見的干擾素誘導劑有：病毒、細菌及其產物、致裂原（絲裂原） 、特異性免疫誘導、細胞因子（如：IL- 12）。

1. IFN-γ的作用：

• 廣譜抗病毒作用。
• 抗腫瘤作用。
• 免疫調節作用：在細胞免疫過程中，大劑量 IFN- γ 起抑制作用，而小劑量可以產生促進作用。體液免疫中，小劑量 IFN- γ 主要發揮抑制抗體產生的作用。
• 抗入侵微生物作用。

1. IFN- γ 的受體在人體內廣泛存在，人類細胞幾乎均存在 IFN- γ 受體。但在單核細胞中的分布更多，可證明其為 IFN- γ 的主要靶細胞。IFN- γ 結合在由 IFNGR1 和IFNGR2 兩個亞單位組成的糖基化的異質二聚體受體上。IFNGR1 直接與 IFN- γ結合， IFNGR2 為輔助亞基，與 JAKs 和 STATs 相互作用，觸發下游的活化訊號。

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BST2

干擾素誘導的抗病毒宿主限制因子，可通過將新生病毒體直接束縛在感染細胞的膜上，從而有效地阻止多種哺乳動物包膜病毒的釋放。充當直接的物理束縛，將病毒體保持在細胞膜上，並使病毒體彼此連接。束縛的病毒體可以通過胞吞作用而內在化，然後降解，或者它們可以保留在細胞表面。

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Edu細胞增殖檢測

EdU可以在DNA複製的時候摻入到新合成的DNA鏈中，通過一個「Click」反應，把熒光基團標記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣我們就能通過檢測熒光而知道細胞的增殖情況了。

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髓鞘少突膠質細胞糖蛋白 MOG

髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG）是一種存在於中樞神經系統髓鞘最外層含量極微的髓鞘蛋白成分，是免疫球蛋白 IgG1 的一種亞型，有效的調節補體依賴性細胞毒性反應。

把 MOG 抗體用在動物體外或體內研究中提示存在補體介導的脫髓鞘，將 MOG 抗體注射到小鼠的大腦內導致髓鞘和軸索損害，改變軸索蛋白的表達，這些改變是非補體依賴性的並在 2 周內是可逆的，無炎性細胞浸潤，不引起軸索脫失、神經元或星形膠質細胞壞死。

正文

取材區域的選擇

作者選擇了3隻年輕（3個月），3隻年老小鼠（28-29個月）。

作者選擇從SVZ區取材，原因有以下幾點：

1. SVZ是神經的發生地，，相當於人體骨髓是HSC的起源一般。
2. SVZ中有各種細胞類型，並且隨著年齡的增長該部位的功能會減弱。

取到的是整個SVZ組織，通過酶的消化後處理為單細胞，上機測10x。

figure1

從b圖可以看到基本上所有的T細胞都來自於年老小鼠。同時activated neural stem cells and neural progenitors (aNSCs/NPCs) 和 neuroblasts 數量上年老小鼠都變少了，而且在轉錄本上的資訊也有所不同。

c圖中可以看出，在年老小鼠中，T細胞的數目主要表現為增加。

d圖展示了每一群細胞轉錄組的變化情況：可以看到microglia, endothelial cells and oligodendrocytes 這些細胞中轉錄資訊改變明顯。

e圖通過免疫熒光染色：看到年老小鼠SVZ區中T細胞（CD3陽性）增多，並且在空間上T細胞靠近NSCs（SOX2陽性）。同時supplement2a圖中證實了這些T細胞和血管內皮細胞（CD31）並不是共定位關係，證明了這些T細胞不是血液中的T細胞，而是腦實質中的T細胞。

f圖展示了年輕和年老小鼠SVZ區T細胞的數量關係。

g圖展示了年輕和年老小鼠SVZ區aNSCs細胞的數量關係。

看到這裡，我們也許可以推斷一下：年老小鼠SVZ區T細胞數目增多，aNSCs細胞卻減少；而在年輕小鼠中則正好相反，那麼是不是在T細胞和aNSCs細胞之間存在著相互影響呢？

上面的h圖是年老小鼠的轉錄組數據，可以看到主要是CD8+CD4- T cells 。

i圖則從轉錄組水平展示了年老小鼠中各種T細胞的情況。也可以看出主要是CD8+CD4- T cells 。

上面的是年老小鼠的流式數據，可以看到主要是CD8+CD4- T cells 。

前面的圖雖然說明了在年老小鼠神經組織中，有大量的CD8+T細胞存在，並且NSCs細胞減少。但是如果這種現象在人中沒有體現，那麼這個結論也只是interesting，而沒有任何價值。所以，在圖l，m中，作者拿老年人的腦組織（沒有神經退行性疾病）側腦室區域的切片做了免疫熒光和計數，發現這種現象也在老年人的腦組織中存在。這就證明了這個現象的研究價值。

figure2

既然上面找到在年老小鼠和人中都有大量的T細胞存在，那麼接下來理所當然大家就想看看這群T細胞到底有什麼特殊之處了。於是作者收集了同一個小鼠的腦組織中的T細胞和血液中的T細胞，利用smart-seq v4進行建庫測序。

圖a：發現降維後blood中的T細胞和SVZ區的T細胞完全不同。分成了2群。

圖b：SVZ區的T細胞高表達INF-γ（ifng）和PD-1（Pdcd1）。

在發現了SVZ區的T細胞增多後，一個很簡單但是卻又很關鍵的問題就是這些T細胞是哪裡來的？是因為年紀大了後血腦屏障減弱了，還是年老後腦組織中有特殊的抗原存在，吸引了這些T細胞呢？

如果是血腦屏障減弱了，那麼就是blood中的T細胞進入了腦組織，但是圖a已經證明了不是這個原因，那麼是不是因為腦組織中有特殊的抗原表達呢？如果是這個原因，那麼所有增殖的T細胞應該都有相同的TCR。為了驗證這個問題，於是作者又做了下面的實驗：

通過檢測TCR-β鏈的基因結構，判斷T細胞是否由一種T細胞大量擴增而來。

c圖：根據轉錄組數據，總結了4個小鼠中每一個樣本所有的TCR-β鏈中基因片段的數目。

d圖：同樣對2隻年老小鼠進行巢式PCR來驗證。和上面的c圖一樣。

e圖：分別展示了在SVZ和blood中T細胞克隆的數目。（我沒看methods）可能是統計TCR-β基因的種類，如果只有一種就是single clone。如果是2種就是clone size = 2，以此類推。

f圖：在SVZ和blood中，整個TCR-β基因序列種類之間的overlap情況。可以看出SVZ和blood中的TCR-β基本上沒有數目overlap，也就是說，SVZ和blood中的T細胞是2群不同的T細胞。

上面的所有試驗證明了，SVZ區的T細胞來源於一個不同於blood的T細胞的大量擴增。並且這類T細胞還有較高水平的INF-γ轉錄本水平。

figure3

作者通過看轉錄組資訊，發現多種細胞類型表達有INF-γ受體，同時也表現出來了隨年齡增長而增強的對INF-γ反應的訊號。

圖a：從MSigDB 資料庫找到一組反映對INF-γ反應的訊號。可以看出astrocytes/qNSCs, aNSCs/NPCs , endothelial cells and microglia 這些細胞對INF-γ的反應增強了。

圖b：不同年齡，不同細胞類型中反映對INF-γ反應的基因表達情況——實際上縱坐標就是反映細胞對INF-γ反應的情況。只有neuroblasts 和T cells 的P值是不顯著的。也就是說，其他細胞對INF-γ的反應都是在年老小鼠中有所增強的。

圖c-i：通過免疫熒光和流式分析，發現在年老小鼠的aNSCs/NPCs, microglia and endothelial cells中，STAT1蛋白（INF-γ訊號傳導下游分子）和年輕小鼠相比是顯著增加的。於是作者就認為年老小鼠中，這些細胞對INF-γ的反應性增強。

個人認為這裡的驗證似乎不夠有說服力，畢竟STAT1這個訊號分子在很多訊號的傳導中都會存在作用，如果只是用著一個蛋白去驗證這個想法，似乎說服力不強呀！

Extended Data Fig. 5

a圖：使用PCA分析，以反映對INF-γ反應性的基因作為PC進行降維展示。其中有黑色外環的小紅點表示對INF-γ反應性強的細胞。

b圖：3個10x樣本，用上述方法進行PCA降維展示。

c圖：換用另外一種數據展示的方法，數據來自3個10x樣本，黑點表示對INF-γ反應性強的細胞。

年老小鼠中，astrocytes/qNSCs 和 aNSCs/NPCs 細胞群里，有一群對INF-γ反應性強的細胞亞群。

圖d：（左）根據流式的結果，展現了在PROM1+的NSCs細胞中，2個年輕小鼠2和年老小鼠中STAT1的表達水平。

（右）15個年輕小鼠和14個年老小鼠STAT1的表達情況。

根據上述結果，作者認為年老小鼠NSCs對INF-γ反應性具有異質性。

那麼作者就想看，這些對INF-γ具有高反應性的細胞和其他同類型細胞之間有什麼區別呢？

於是作者找到一個表面marker——BST2，這個蛋白和INF-γ反應性相關，可以在INF-γ的作用下限值病毒囊泡的釋放。

上面的圖證明了在年老小鼠aNSCs細胞群里有BST2高表達的一小亞群。

figure4

圖a：利用流式分析技術，找到了年老小鼠aNSCs/NPCs細胞群里有BST2高表達的一小亞群。並確定了圈門時的熒光強度。後面通過這個圈門策略，收集到足夠的BST2+的細胞。

圖b：通過bulk測序，分別測了BST2+的細胞和BST2-的細胞，找出差異基因，然後做GO和KEGG富集分析。可以看到大部分富集在對IFN-γ的反應。和前文中的結論符合。證明了用這個marker來收集細胞的可靠性。但是也發現這群細胞的cell cycle非常不活躍。

既然看到了這群細胞的cell cycle有問題，那麼當然需要去看以看原因了。於是作者又做了Edu細胞增殖檢測。可以看到的確是BST2-的細胞增殖活性更強。作者在這裡就認為，這群細胞出現了功能的異常。

（難道NSC本身就有很強的增殖活性嗎？）

接下來作者就像知道是什麼導致了這些對INF-γ反應性強的細胞亞群。考慮到前面的種種結果上，作者於是將重點放在了T細胞上。

圖d：通過免疫熒光，作者觀察到在有T細胞臨近的情況下，NSCs中的BST2訊號活性就強。

作者又將髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG）注射到年輕小鼠腦中，結果發現BST2+NSCs細胞數增多。但是這裡需要注意的是目前大家對與MOG這個蛋白分子的功能還不是很了解，但是在許多神經系統疾病中可以檢測到MOG的存在。所以作者在這裡也沒有下很明確的結論。只是說T細胞會損害NSCs的增殖能力，而沒用說是因為MOG這個蛋白抗原引起了T細胞的大量增殖。

為了證明T細胞可以直接影響NSCs的增殖能力，作者將來自脾臟的CD8+T細胞和年輕小鼠的NSCs進行共培養。

圖f：整個過程圖。

圖g：在IL -12、IL -12和IL -18的共同作用下，T細胞會大量分泌IFN-γ。這裡分別做了NSCs+CK（細胞因子）、NSCs+T cell+CK、NSCs+CK+IFN-γ抗體以及NSCs+T cell+CK+抗體同型對照。

圖h、i：確認了就是IFN-γ在引起NSCs中BST2的表達增加以及增殖活性的減弱。

通過以上數據，大致可以說是T細胞分泌的INF-γ引起了NSCs中BST2的表達增加以及增殖活性的減弱。