單細胞技術揭示平滑肌細胞表型調節和TCF21疾病基因在抗動脈粥樣硬化過程中的作用

• 2020 年 3 月 30 日
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單細胞天地小編：火燒甜蛋茶

今天帶來的這篇文章是2019年8月發表在Nature Medicine上，題為Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis。

總覽

為了響應各種刺激，血管平滑肌細胞（SMC）可以在表型調節的過程中去分化，增殖和遷移。但是尚不清楚動脈粥樣硬化期間體內調節性SMC的表型以及該過程對冠狀動脈疾病（CAD）風險的影響。作者使用單細胞RNA測序技術，全面表徵了小鼠和人類動脈粥樣硬化病變中調節性SMC在體內的轉錄表達，並發現這些細胞能夠轉化為獨特的成纖維細胞樣細胞，稱為「成纖維細胞」，而不是經典細胞巨噬細胞表型。TCF21-a（一種致病性CAD基因）的SMC特異性基因敲除顯著抑制了小鼠的SMC表型調節，從而導致損傷內以及損傷保護性纖維帽內的纖維細胞的減少。此外，在患者的人冠狀動脈中，TCF21的表達與SMC表型調節密切相關，而在人CAD相關的組織中，較高的TCF21表達水平與降低的CAD風險相關。這些結果確立了TCF21和SMC表型調節在這種疾病中的保護作用。

主要實驗方法

流式細胞術、10xChromium單細胞轉錄組建庫（Illumina HiSeq 4000儀器測序 ）、CITE-seq(與10x文庫合併用Illumina HiSeq 4000儀器測序 ）、免疫組化、RNAscope原位RNA檢測技術、ChIP-Seq 。

PS：CITE-seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing）通過測序來進行轉錄組和表位的細胞索引技術的新型測序技術，能夠對數千個單細胞的表面蛋白標記物進行測定，同時還能夠對相同單細胞中的信使RNA進行測序。

樣本

小鼠從主動脈根和上升主動脈分離的細胞，兩組：tdT+（SMC origin細胞）和 tdT-（所有其他細胞）

人類動脈粥樣硬化性冠狀動脈的離體細胞

主要結果

單細胞RNA測序（scRNA-Seq）定義了小鼠動脈粥樣硬化的細胞組成，並顯示Tcf21表達在SMC表型調節過程中被上調

小鼠在高脂飲食（HFD）和疾病發作之前接受它莫西芬治療時，所有SMC（以及隨後增殖產生的任何後代）都被tdT熒游標記。為了檢測單細胞基因表達，作者使用了流式細胞術將從主動脈根和升主動脈分離出的細胞分為兩組：tdT +（SMC起源）和tdT-（所有其他細胞類型）。用10x 技術分別在兩組細胞上進行scRNA-Seq，然後將所有時間點的tdT +和tdT-數據集合併分析。圖a-c：t-SNE 圖分群顯示，8周高脂，16周高脂飲食後的測序結果可以看出SMC表型轉化類群逐漸出現（粉紅色群）。圖d可視化所有已被FACS分類為tdT +並因此為SMC譜系的細胞，發現該疾病相關細胞簇中的絕大多數細胞都是SMC衍生的。圖e列出了定義a-c中每種細胞簇類型的前8個基因。 每個圓圈的大小代表每個簇中表達每個基因至少一個檢測到的轉錄本的細胞比例。圖f：Tcf21+細胞在不同細胞類型細胞群中的佔比。

疾病期間體內的SMC表型調節導致其形成特定的成纖維細胞樣細胞

圖2a-g顯示了SMClin小鼠在所有時間點的數據。在表型調節的SMC簇中，SMC分化的標誌物包括轉膠蛋白（Tagln，圖b）和鈣蛋白（Cnn1，圖c）顯示來自親代SMC譜系的遞減表達梯度，以及Lgals3（ SMC表型調節的已知標記，圖d），表明這些細胞正在經歷SMC表型調節。在該細胞組中，還有許多其他基因顯著上調，包括纖連蛋白1（FN1，圖e），骨保護蛋白（Tnfrsf11b；圖f）和膠原蛋白1α1(Col1α1 ）。圖中結果還顯示了細胞類群變化的方向。作者還用IPA分析方法分析了SMC轉化過程中差異基因富集到的通路。

Tcf21在SMC中的缺失抑制了表型調節

為了確定Tcf21對SMC表型調節的作用，作者在SMC特異性條件性Tcf21基因敲除小鼠（SMClin-KO）的主動脈根和升主動脈中進行了scRNA-Seq。作者在16周疾病時間點的scRNA-Seq數據中測量了收縮性SMC和纖維細胞的比例，發現與SMClin對照的SMC相比（圖a），SMClin-KO小鼠的SMC減少了 進行表型調節的能力（圖b）。在疾病的8周和疾病16周時均觀察到SMC調節的降低（圖c）。較大群小鼠的主動脈根部斑塊特徵支援了scRNA-Seq的發現。提示該基因敲除能夠顯著抑制小鼠中SMC的表型轉化現象。

人冠狀動脈中的SMCs顯示了相似的纖維細胞表型

為了明確是否可以在人類中觀察到在小鼠中的發現，作者在人類動脈粥樣硬化性冠狀動脈的離體細胞中進行了scRNA-Seq。將四個心臟移植受者的右冠狀動脈內的病變部分解離並進行scRNA-Seq。圖中結果顯示，根據每個簇中最重要的定義基因來區分細胞類型。作者還用Seurat包將小鼠與人的數據聯合分析，發現這種方法可以將每個物種的已知直系同源細胞類型準確地聚在一起。

總結

本研究使用單細胞轉錄組測序技術，分析了小鼠和人類動脈粥樣硬化病變動脈中存在SMC的表型轉化，並且發現這些細胞轉化為獨特的成纖維細胞樣細胞，被稱為"纖維肌細胞"，而不是傳統認為的經典的巨噬細胞表型。SMC中特異性敲除TCF21 基因對小鼠SMC表型轉化的影響。該研究使用的分析方法比較特別，將小鼠和人的數據放在一起分析，感興趣的同學可以仔細研究研究~