愛恨難分—癌症免疫治療獲得性抗性

2020 年 3 月 27 日
筆記

文獻詳解欄目

每個人的時間精力有限，必須優先閱讀相關文獻，開設這個欄目也是希望為大家推薦高品質的單細胞相關文獻。如果大家對單細胞轉錄組感興趣可以關注一下，哪怕每天只學一點點，積土成山，積水成淵。

當然一個人的力量終歸是小的，我也希望匯聚一群人，形成一個場，這裡頭最重要的生產力不是單個人多聰明，多厲害，而是每個人相互作用，形成的那個氛圍。

希望大家能有所收穫！

文章資訊

這一篇是免疫相關，美國Fred Hutchinson癌症研究中心於2018年9月發表在NC的Acquired cancer resistance to combination immunotherapy from transcriptional loss of class I HLA，本文的重點在於單細胞數據的分析部分

背景知識

HLA（human leukocyte antigen）：人類白細胞抗原，它是一組緊密連鎖的基因群，可以控制細胞間相互識別、調節免疫應答。HLA的部分基因可以編碼細胞表面抗原受體，成為自身細胞的"獨特的訊號"，可以作為免疫系統區分自身和異體物質的基礎 HLA抗原決定簇在Chr6的短臂上，分為三類：Class I、II、III，是目前已知的人類染色體中基因密度最高，也是多態性最為豐富的區域，IMGT/HLA 資料庫中就記錄了HLA Class I、II的基因型，截止2019.4已經記錄了22,528個等位基因

(圖片來自文章：Role of MHC-Linked Susceptibility Genes in the Pathogenesis of Human and Murine Lupus) Class I基因編碼的抗原受體幾乎分布於整個細胞表面，作用是呈遞內源性抗原； Class II編碼的白細胞抗原只有在吞噬細胞(如巨噬細胞、B細胞)的表面存在，作用是呈遞外源性抗原； Class III 編碼的產物主要參與補體系統的調節 Class I、II基因參與免疫調節，因此它們的等位基因是研究熱點(I類主要看A、B、C基因；II類主要是DR、DQ、DP基因)
Merkel細胞癌：皮膚Merkel細胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC)是一種罕見的皮膚侵襲性惡性腫瘤，由Merkel cell polyomavirus (MCPyV)病毒引起。常見於淺膚色的老年人，有局部複發和區域淋巴結轉移的傾向。其他名稱如：皮膚神經內分泌癌或原發性小細胞癌、小梁細胞癌等。最早於1972年由Toker報道，發病人群中95%為白種人，男性發病率高於女性，且隨著年齡增長穩步升高。疾病相關死亡率約為33%~46%，局部MCC患者的5年總生存率為55.6%；晚期疾病患者區域性淋巴結患者5年生存率為35.4%，遠處轉移患者約為13.5%。臨床試驗最新結果表明，免疫檢查點抑製劑可用過釋放抵抗免疫原性腫瘤的抗腫瘤免疫力來改善治療結果來自：http://news.medlive.cn/cancer/info-progress/show-141930_53.html
免疫檢查點： 調節T細胞活化和增殖的主要分子。首個免疫檢查點抑製劑靶向的是CD152（CTLA-4），ipilimumab是同類中第一個證實臨床試驗中轉移性黑色素瘤患者總生存率改善的藥物（2011年獲批）。後來如PD-1/PD-L1抗體問世。免疫檢查點抑製劑在多種癌症中的成功應用以及MCC的免疫易感性再次為研發更有效的MCC治療方案帶來希望。
ICIs(immune checkpoint inhibitors)/ICB(immune checkpoint blockade): 免疫檢查點抑製劑。T淋巴細胞是抗腫瘤免疫應答中的主要效應細胞，通過識別腫瘤特異性抗原(比如致癌病毒、分化抗原，表觀遺傳調控分子, 以及致癌過程中產生的新抗原等)產生細胞毒性反應。正常狀態下, T淋巴細胞通過表達一系列激活性(促進T細胞分化增殖)和抑制性(抑制T細胞分化增殖)受體來調控免疫平衡，既可以調控生理性免疫應答, 又不會過度激活免疫系統而造成機體自我損傷。但是腫瘤微環境中，隨著腫瘤抗原對T細胞的持續刺激, T細胞表面的一系列抑制性受體表達水平升高，同時配體在癌細胞或抗原呈遞細胞表面表達水平增高，將抑制T細胞活化增殖並誘導T細胞凋亡，從而導致免疫抑制性腫瘤微環境形成，造成免疫逃逸。 T細胞表面表達的抑制性受體主要包括CTLA-4、PD-1、Tim-3、LAG-3、KIR、CD47、TIGIT、CEACAM1、A2AR、IDO1、BTLA、VISTA、CD276、VTCN1等，這些抑制性受體所對應的抑制性訊號通路稱為免疫檢查點（來自 https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v25/i19/1714.htm
腫瘤新生抗原負荷（tumor neoantigen burden， TNB）：癌細胞不斷擴增分裂，會產生很多新的突變。新的突變有一部分會形成新生抗原，新生抗原可以激活免疫系統。因此腫瘤新生抗原負荷越高，對這個藥物的反應性就有可能越大
外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)：

研究背景

癌症免疫治療在臨床上前景巨大，但是目前有許多使用這種技術的患者後來出現複發的狀況。

本文團隊在研究Merkel細胞時發現，20%的患者對免疫治療有初步反應，但後來存在複發的情況，預後不理想。為了提高預後，理解後期/獲得性免疫治療耐受性的機理是有必要的。利用細胞免疫治療臨床試驗，可以表徵T細胞《=》抗原的相互作用，進而了解複雜的腫瘤細胞-免疫細胞之間的關係，並且為避免腫瘤複發應採取何種免疫聯合療法提供幫助。

研究方法

大體思路就是：癌症患者免疫治療=》發現抗性複發=》scRNA-Seq=》研究獲得性抗性機理

最初採用聯合療法對兩名Merkel患者進行治療，發現腫瘤逐漸縮小，他們出現的顯著的腫瘤消退都與活化的CD8+T細胞浸潤到消退的腫瘤組織有關。

這兩例患者分別為：

The primary patient (2586-4) received hypofractionated radiation for HLAupregulation to some but not all disease sites
The second validation patient (9245-3) is a 59-year-old man with metastatic MCC that had initially presented as stage IIIB disease, now metastatic at multiple sites

取了患者的血液和腫瘤，做了免疫組化、分選、外顯子測序、10X scRNA-Seq、qPCR

外顯子測序

兩個患者2586-4 (discovery) and 9245-3 (validation)，從外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中分離DNA作為germline對照，然後取出腫瘤免疫治療前以及獲得性抗性的樣本。

患者2586-4採用Agilent SureSelect Human All Exon V6 晶片+HiSeq 2500，annovar比對hg19，MuTect檢測somatic突變；

患者9245-3採用xGen建庫+Hiseq4000(100X)，BWA比對到hg19，GATK call variants

如果大家對WES數據分析感興趣，出門左轉去B站學習群主的影片：

https://www.bilibili.com/video/av28030610

本文重點解讀單細胞轉錄組部分！

單細胞測序【重頭戲】

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1– 原始數據

患者2586-4：利用10X 3' Chromium v2.0平台建庫 + Hiseq2500 "rapid run"模式；

GSE117988

ID                                  Description    GSM3330559    Tumor    Disc    Pre  GSM3330560    Tumor    Disc    AR    GSM3330561    PBMC    Pre  GSM3330562    PBMC    Disc     Early  GSM3330563    PBMC    Disc    Resp  GSM3330564    PBMC    Disc    AR

患者9245-3：利用10X 5' V(D)J 進行cell washing, barcoding and library prep+ NovaSeq 6000(gene expression) + Hiseq4000 (V(D)J)

GSE118056

ID                                       Description    GSM3317833    PBMC    Relapse - L001  GSM3317834    PBMC    Relapse - L002  GSM3317835    Tumor    Relapse - L001  GSM3317836    Tumor    Relapse - L002

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2– Transcriptome alignment, barcode assignment and UMI counting

患者2586-4(discovery) 利用Cell Ranger v2.0.0， 9245-3 (validation)利用Cell Ranger v2.1.0，進行sample demultiplexing, barcode processing and single-cell gene counting。

首先，利用mkfastq流程將原始的BCL文件轉為fastq；然後，利用count流程整合了STAR將每個fastq與hg38和Merkel cell polyomavirus序列（HM011556.1）比對，比對後的reads根據cell barcode以及UMIs進行過濾

Cell barcodes with 1-Hamming-distance from a list of known barcodes were considered；UMIs with sequencing quality score >10% and not homopolymers were retained.

接著利用aggr流程將Tumor與PBMC樣本整合，生成兩個gene-barcode表達矩陣(tumor和PBMC的)，同時進行了測序深度的校正！

後面我們會直播這個數據的全部分析流程，復現文章的全部分析圖表，歡迎大家持續關注！！！

當然，如果你迫不及待想自行學習，也可以關注我們的影片課程：全網第一個單細胞轉錄組數據分析實戰影片教程(預售第二波通知)

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3– Data normalization and correction

根據這篇文獻的方法：Miller, N. J. et al. Tumor-infiltrating Merkel cell polyomavirus-specific T cells are diverse and associated with improved patient survival. Cancer Immunol. Res 5, 137–147 (2017).

利用Seurat包中的ScaleData 函數進行校正和標準化：

Only genes with at least one UMI count detected in at least one cell were retained for analysis.
Library-size normalization was performed for each cell.
UMI counts were scaled by the total number of UMIin each cell and multiplied by the median of the total UMI counts across cells
log2-transformed and corrected for unwanted sources of variation

corrected-normalized gene-barcode matrix 文件將作為下游降維、聚類的輸入文件；

normalized gene-cell barcode matrix文件將進行MAST analysis

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4– Gene expression analysis: discovery patient tumor

過濾得到了7431 tumor cells (2243 cells before and 5188 cells afterT cell therapy)，然後利用corrected-normalized gene-barcode matrix進行PCA、tSNE

首先，利用Seurat挑出了873個表達量變化最大的基因進行PCA

根據：log-mean expression values > 0.0125 and dispersion(variance/mean) >0.5

接著，挑出前10個PCs進行tSNE

One thousand iterations of tSNE using a perplexity value of 30 were performed

然後利用MCC tumor markers(NCAM1, ENO2, CHGA and KRT20 and TILs)細胞分群、聚類，得到T細胞免疫治療前的1984個癌細胞和治療後獲得抗性的5131個細胞；

又利用MAST的R包對前後的細胞進行差異分析，利用的是normalized gene-cellbarcode，其中利用了cellular detection rate (CDR) 作為協變數，校正可能影響細胞中檢測到基因數的生物和技術偏差。差異基因定義為FDR為5%，fold change>1.3

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5– Gene expression analysis: discovery patient PBMC

PBMC涉及到了4個時間點：pre-treatment、early post treatment day+27、responding post treatment day +37、replace/acquired resistance post treatment day +64

過濾後總共得到12,874個細胞，也是利用corrected-normalized gene-barcode matrix進行PCA、tSNE分析。

首先，選擇1203個變化最大的基因；然後選10個PCs進行tSNE(同上)；細胞聚類使用Seurat的FindCluster函數，得到13個不同的細胞群(參數：neighborhood size of 40 and resolution of 0.6)，根據分群的結果，移除了三個在red blood cell and megakaryocyte markers中富集的cluster，總共剩下11,021個細胞；之後利用FindMarkers函數根據marker的富集情況，給細胞群加標籤，結果有9個不同的cluster：CD4+ T cells, CD8+ T cells, CD8+ effector T cells, B cells, NK cells, CD14+ monocytes, CD16+ monocytes, myeloid cells and dendritic cells；CD8+與CD8+ effector T細胞的在第三個時間點（responding階段）差異基因分析也是利用MAST。程式碼見Supplementary Data 3.

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