病毒研究新進展！首次人工合成活新冠病毒可幫助提供病毒毒株

近日，瑞士科研團隊在已知新冠病毒基因序列的基礎上，通過反向遺傳學手段在酵母菌中快速構建出了活的新冠病毒。

據悉，該技術能高效合成新冠病毒，尤其在新爆發病毒尚未被成功分離出之前，可以幫助科學家儘快向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株，且該替代方案更為高效、安全。

其論文成果“Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform”於2020年2月21日發表於BioRxiv，尚未經同行審議。

利用反向遺傳學構建新病毒，意義何在？

公開資料顯示，該項研究的科研團隊大多來自瑞士伯爾尼大學的科學家，他們聯合德國、俄羅斯多所科研院校與相關衛生機構共同完成了該科研成果。

研究團隊認為，利用已知的病毒基因組序列，通過反向遺傳學手段快速構建出了新冠病毒，可以成為向衛生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株的替代方法，還可以對單個基因進行遺傳修飾和功能表徵，從而爭取時間對疫情爆發做出快速反應。

論文中提到，反向遺傳學被認為是一種不可或缺的工具，它能夠改變了人類對病毒發病機制和疫苗開發的認識。

像冠狀病毒基因組這一類大型的RNA病毒基因組，由於基因組較大且不穩定，很難在大腸桿菌宿主中被克隆和操作，因此需要一種快速而強大的反向遺傳學平台進行研究。

此次，瑞士研究團隊報道了一個基於酵母的合成基因組學平台，用於多種RNA病毒的基因重建，包括冠狀病毒科、黃病毒科和副粘病毒科等。

研究人員利用病毒分離物、克隆病毒DNA、臨床樣本或合成DNA生成病毒亞基因組片段，然後使用轉化偶聯重組技術(TAR）克隆技術將基因組維持為酵母人工染色體（YAC），從而在釀酒酵母中實現一步重組。而T7-RNA聚合酶則被用於產生病毒RNA，進而可以產生活病毒。

研究團隊首先在其他RNA病毒（如鼠肝炎病毒MHV）中檢驗了這一平台的準確度，團隊測試了鼠肝炎病毒A59株中含有綠色熒光蛋白（MHV GFP）的基因克隆能力，結果表明測試的克隆中正確組裝了MHV基因組的YAC佔90%，這表明病毒在酵母中的組裝效率很高。

也正是利用該平台，研究人員在拿到合成DNA片段後一周內，對新冠病毒進行了工程改造和復活。

值得一提的是，這是一項根據已知病毒基因組進行病毒重建的基礎研究工作，該成果與此前的謠言之一“新冠病毒是人工合成的”無關，該研究中實驗室中構建的新冠病毒是在疫情爆發後，根據已經公布的病毒基因組序列進行的病毒重建研究。

如何對新型冠狀病毒進行工程改造和復活？

具體來看，研究團隊將病毒基因組分成 12 個片段，大小在 0.5kbp-3.4kbp。同時，為了便於血清學診斷和在細胞培養時追蹤，研究團隊將合成新冠病毒設計成可以表達 GFP（綠色熒光蛋白）。

因此，研究團隊又將片段 11 分成 3 個包含 GFP 序列的子片段，GFP 序列被插入 ORF7a（開放閱讀框，ORF）中從而在總計有 14 個片段。

研究團隊讓試劑公司化學合成上述 14 個 DNA 片段，1 月 14 日下訂單，2 月 4 日拿到其中的 12 個片段。片段 5 和 7 在大腸桿菌中的克隆出現一些問題未能完成。

不過，研究團隊恰好同時獲得了慕尼黑一位患者的新冠病毒樣本（SARS-CoV-2/München1.1/2020/929），他們決定利用 RT-PCR 擴增獲得片段 5 和片段 7。

利用 TAR 克隆，研究人員獲得了所有 6 種新冠病毒構建體正確組裝的分子克隆。

隨後，研究人員利用轉化偶聯重組技術（TAR），用酵母菌的同源重組系統依據末端重複的序列，將這些 DNA 序列拼到一起。

獲得完整的病毒序列後，研究人員用 T7 RNA 聚合酶將這一 DNA 序列轉錄為病毒 RNA，將該 RNA 用電穿孔技術導入到 VeroE6（猴腎細胞）中，使得細胞被感染，培養這些細胞的上清液（含釋放出的病毒顆粒）注入到別的培養基中，可以感染別的細胞。

基於此，瑞士研究團隊宣布，他們能在獲取病毒的合成 DNA 片段後僅一周的時間內，對最近流行的新冠病毒的化學合成克隆進行工程改造和復活。並且，其病毒的重組有很高的效率和準確度，通常情況下，超過 90% 的克隆是正確的。

值得注意的是，研究人員還指出，儘管此前在酵母中進行同源重組已被用於很多分子病毒的克隆，但這一研究在對通過這種方法快速生成大型RNA病毒的全長cDNA的可行性進行了全面評估，尤其是這種大型RNA病毒在大腸桿菌中無法被穩定克隆。

值得注意的是，除新冠病毒外，研究團隊還報道了利用該技術合成構建MHV（鼠肝炎病毒，一種冠狀病毒）和MERS-Cov等，而HCov-229E和Zika病毒的構建仍在實驗進行中。