免疫組織化學實驗

2019 年 10 月 4 日
筆記

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是通過共價鍵將酶連接在抗體上，製成酶，標抗體，再利用酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，於普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位。目前通常選用免疫酶組化間接染色法進行實驗，利用該技術，可進行細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質（如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等）。由於免疫組化具有特異性強、靈敏度高、定位準確等特點，且能將形態研究與功能研究有機地結合在一起，這門新技術已被廣泛地應用於生物學和醫學研究的許多領域。在病理學研究中，免疫組化技術的作用和意義更為重要。

下面是2個影片的中的操作步驟，關於免疫組化，我們之前也發過文章：免疫組化實驗，可以進行參考。

實驗前準備

在實驗開始前，要先確保該實驗所用到的試劑都準備到位，如：不同濃度梯度的乙醇， PBS 緩衝液， 3%過氧化氫， 10%正常山羊血清， 0.01M 枸櫞酸緩衝液，DAB 顯色液，二甲苯和抗體等。

本實驗所使用到的儀器和耗材有：芬蘭百得提供的移液器，賽默飛的 QSP盒裝吸頭、恆溫箱，醫用微波爐，蓋玻片，鑷子，洗瓶，濕盒，切片架等。本影片按照以下步驟展開實驗：脫蠟復水後進行抗原修復，接著免疫反應，化學染色，最後脫水封片並進行結果分析。

脫蠟復水

首先對組織切片進行脫蠟復水處理：切片在室溫放置 60min 後，浸泡在二甲苯中。10min 後，放入另一個裝有二甲苯的染缸再泡 10min。脫蠟後，將組織切片逐級放入無水乙醇、 95%、 85%， 75%， 50%的乙醇中，每次處理均為 5min。水合處理後，將組織切片放入純水中，孵育 5min，再轉移放入 PBS 緩衝液中孵育 5min。

抗原修復

抗原表位修復之前，需進行內源性過氧化物酶的淬滅處理：滴加 3%過氧化氫溶液於切片上，濕盒孵育 10min。用 PBS 浸泡清洗 3 次，每次 5min，儘可能洗去殘留的過氧化氫。將切片浸入 0.01M 枸櫞酸緩衝液中，微波中大火力加熱至沸騰並保持 8min，取出容器，待緩衝液溫度自然降到室溫。反覆 2 次，用PBS 再洗 5min。

免疫反應

用濾紙擦去周圍多餘的 PBS，滴加 PBS 稀釋好的 10%正常山羊血清，室溫濕盒封閉 30-60min。孵育結束後，去除封閉液，滴加一抗工作液， 4°C 孵育過夜。第二天，移去一抗後，用 PBS 洗兩次，每次 10min.擦去切片周圍多餘的液體，滴加二抗工作液，室溫孵育 30min。棄去二抗後， PBS 洗兩次，每次 10min。

化學染色

去除切片上多餘的 PBS,滴加新鮮配製的 DAB 工作液，濕盒孵育，在顯微鏡下監測染色程度。染色結束後， PBS 浸泡洗去 DAB 染液，每次 5min，重複 3 次。去除殘留液體，蘇木素復染 2-5min，復染結束後，用水洗去多餘染液，在 1%鹽酸酒精中分化數秒。再次進行水洗切片。

脫水封片

此過程剛好和復水相反，首先進行 50%乙醇處理 5min，然後依次浸泡在 75%，85%， 95%和無水乙醇中，時間 5min，最後置於二甲苯中進行透明化處理兩次，每次均為 10min。脫水處理後，擦去切片周圍的液體，滴上 1 滴中性樹膠，蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片完全。

結果觀察

在顯微鏡下觀察實驗結果，並於相同的條件下拍取照片進行後續的結果分析。如圖所示，蘇木素復染細胞核後，細胞核被染上藍色，實驗組胞漿剪呈現棕黃色，陽性訊號較強；陰性對照組胞漿不被 DAB 染色。

半定量分析

使用 Image Pro Plus 影像分析軟體分析累積光密度值。打開 Image-Pro Plus軟體，點擊 File，打開實驗組和對照組的結果圖片。點擊 Measure。Calibration，點擊 Intensity 進行光密度校對。在 Intensity Calibration 窗口中，點擊 New，選中 Std.Optical Density，點擊 Optical，點擊 Image，選擇圖中最亮的一點。在 Incident Level 中輸入與其最接近的整十數，點擊 ok。校正光密度後，點擊 Measure，Count/ Size。在 Count Size窗口，點擊 Measure，Select Measure，選擇測量對象。選中 Area（面積）和 IOD（累積光密度），點擊 OK。回到 Count /Size 窗口，點擊 Select Color。在 Segmentation 窗口，選擇 Histogram Based， HIS 通道。調節飽和度等參數後，點擊 Close。選中一張圖片，在 Count Size 窗口，點擊 View，在 Statistics 窗口可見結果。獲得累積光密度值後，可選用相關軟體進行統計學分析。

疑問解答

Doctor A，最近做免疫組化的結果非特異性染色都很深，該怎麼解決呢？

Miss Q，非特異性染色是在做免疫組化中經常遇到的問題，最重要一點，我們可以通過調節一二抗的濃度和孵育時間來控制。至於抗體，建議用單克隆抗體，可減少非特異性染色。通過延長封閉時間、適當增加封閉液濃度也能降低非特異性組分與抗體的結合。DAB 的顯色要在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應，避免染色時間過長或 DAB 濃度過高。此外，很多同學在標本染色過程中經常乾片，這容易增強非特異性著色。

謝謝 Doctor A，那免疫組化染色呈陰性結果，這又是怎麼一回事呢？

遇到這種情況，一般可以從這幾點查找原因：

抗體濃度和品質問題以及抗體來源選擇錯誤；抗原修復不全，對於甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利於與抗體結合；組織切片本身這種抗原含量低；血清封閉時間過長；DAB 孵育時間過短；細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。開始做免疫組化實驗時，建議同學們一定要先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

在孵育抗體前，為什麼要進行抗原修復呢？

剛才也有提到過，抗原修復是為了使抗原抗體更好地結合。石蠟切片由於處理過程中會造成抗原交聯而影響染色結果，通常需要進行抗原修復以增強顯色。多數抗原可以通過抗原修複試劑預處理，改變醛基固定造成的蛋白交聯，以暴露隱藏的抗原位點。抗原修復對於石蠟切片免疫組化、免疫細胞化學的最終顯色結果有著重要的影響。感謝 Doctor A 的悉心講解，這堂課又學到了好多知識。