細胞侵襲實驗

2019 年 10 月 4 日
筆記

對於進行細胞侵襲的研究者來說，傳統試驗方法具有染色及計數會佔用實驗者大量的精力，且數據單一，實驗通量及重複性低等特點。本實驗採用羅氏全新的方法來監測細胞侵襲，將 CIM-Plate 16 結合 RTCA DP Analyzer使用，這個獨特的裝置可在無標記條件下對細胞侵襲進行實時監控。CIM-Plate 16 由上室和下室組成，兩者之間由微孔膜分隔開。金制串珠狀微電極緊密結合，附著於 PET 膜下層，並覆蓋 80%表面積。趨化劑添加到下室，上室內添加研究的細胞和選擇性添加細胞外基質膠。當細胞設法穿過膜，進入下室，黏附到電極上，系統可測量電阻抗變化。隨著微孔膜下側細胞數目的增多，電阻抗增大，表現為細胞指數的變化，並被 RTCA DP Analyzer 記錄下來。接下來，我們介紹整個細胞侵襲實驗的流程。

一、編輯實驗程式

打開 RTCA software，可看到三個用戶許可權 ID，本次實驗我們用 administrator 登錄，密碼為小寫的 administrator。user one 和 user two 登錄時無需密碼。點擊確認後，可根據實驗需求進行選擇適當的 cradle。

啟動 RTCA DP 軟體後，如果軟體仍停留在上一個實驗介面，可以在 file 中點擊 release，開啟一個新的實驗。experiment note 頁面下，填寫本次實驗的相關資訊，包括實驗名稱，所使用細胞板的 ID number 資訊等，備註欄內填寫一些簡單的實驗設計。到 Layout 頁面下，輸入本次實驗的設置，選中 A1-H1，填寫細胞系名稱，細胞類型是 HT-1080，每孔 20000 個細胞，點擊 apply，設置資訊完成。選擇 A1-F1，本實驗將從高到低濃度 Matrigel 進行包被，最高濃度為 10%，以 2 倍稀釋度稀釋，兩個重複。選擇 G1 和 H1，填寫 serum Free Medium 作為空白對照,保存後，將 A1-H1資訊複製到第二排。此時可見 16 孔板設置完成的實驗資訊。轉到 schedule 頁面，點擊增加一步按鈕。第一步是用於檢測背景值的實驗步驟， step-status顯示為 IDLE，表示未完成，請勿更改背景檢測步驟參數。點擊增加步驟按鈕，建立第二個實驗步驟，這裡根據檢測時間的長短，可以自行設計實驗的檢測次數及間隔時間。

二、準備實驗以及包被

從冰箱中取出 Assembling tool 以及 CIM plate 上板。拆開上板，可見板上和蓋子上均有藍點標記，將藍點對藍點，把板放在 Assembling tool 上。由於 CIM plate 板的電極是鋪在孔膜的背部，所以上板不能直接接觸桌面，安裝時需特別注意。首先進行 Matrigel 包被，每孔內加入 50 µl matrigel ，每做完一個梯度，即 4 個孔後，馬上從孔內輕輕吸出 30µl Matrigel。如果出現氣泡，用槍頭小心剔除。空白對照的四個孔同樣加入 50µl 的無血清培養基，然後吸出 30µl。蓋上蓋子，將整個 Assambling tool 連同板子，放入培養箱中孵育 4-5 小時，使 Matrigel凝結。

三、組裝 RTCA CIM Plate-16 以及測量 CI 背景值

取出 CIM plate 下板，藍點對藍點方向，放在 Assambling tool 第二個槽內，下板中加入160µl 預溫好的完全培養基，動作緩慢且在最後輕抬槍頭，可見整個液面形成漂亮的弧形。將 CIM-Plate 16 Assembly Tool 旋轉 90 度，小心不要干擾液面將上板拿起，水平移到下板上方，快速用力扣下，中間不能有停頓，聽到卡卡兩聲，表明上板和下板安裝完成。檢查安裝是否緊扣在一起。在上板中每孔加入 30 µl 無血清培養基，蓋上上板蓋子將整塊 CIM-Plate 16 放入 RTCA DP 分析儀。放在培養箱中平衡一個小時。一小時後，進入 schedule 頁面，選中第一步，點擊開始按鈕。背景值測完後，顯示 ready for starting next step.回到 Message 頁面，看是否有任何報錯資訊。

四、準備細胞，並加入 RTCA CIM Plate-16 上腔

取出 CIM plate，重新放回到超凈台中的 Assambling tool 上，每孔加入 100 微升含 20000個細胞的細胞懸液。細胞準備參照本光碟的細胞傳代及其他影片的相關操作，重懸 HT-1080細胞。為了避免培養箱內由於溫差產生蒸騰作用而引起邊緣效應，將 CIM 培養板，在常溫下靜置半個小時。

五、運行實驗

將 CIM plate 重新放回 RTCA DP 分析儀上，看到提示 plate scanned, connection is OK 後，點擊開始第二步。這時機器開始每 15 分鐘檢測一次孔內細胞的遷移的情況。

六、實驗結果分析

在 Cell Plot 頁面，選擇顯示平均值以及標準差，點擊 add ,可見不同組得到的實驗訊號。如圖所示，當 Matrigel 濃度最大時，細胞侵襲越困難，而無血清培養基對照孔內，細胞侵襲的訊號就非常明顯。根據包被 Matrigel 的濃度由高到低，細胞侵襲能力逐漸增強。

七、注意事項

1、 CIM-Plate 16 不能重複使用：

CIM-Plate 板上可能會有細胞或包被試劑的殘留，影響再次實驗的結果可靠性及重複性。

2、健康的細胞培養物：

健康的細胞侵襲效率較高，此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。實驗細胞必須在前一天進行細胞傳代，並保證消化時細胞融合達 60%-80%

3、 Matrigel 使用要求：

由於 Matrigel 非常容易在常溫下凝結成膠狀而無法使用，要將 Matrigel 置於冰上。侵襲實驗前一天，需要將所需的 Matrigel 從-80 度取出，放在 4 度保存，使其溶解成液狀，另外，所有需要接觸 Matrigel 的耗材，包括槍頭，移液管， CIM plate 上板等需預先放在冰箱-20或者 4 度預冷。

4、無血清培養基製備細胞懸液：

製備細胞懸液前可先讓細胞去血清飢餓 12－24h，進一步去除上板中血清的影響，若上層中含血清，下層培養液的趨化作用就會減弱甚至消失了，影響實驗的進行。