研究Protein,這些技術不得不看

  • 2019 年 12 月 13 日
  • 筆記

RNA最近幾年可火了,RNA小鮮肉F4:miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA,它們直接或者間接調節mRNA的翻譯、基因轉錄,這些科研熱點也成為做實驗發paper的最愛,不管核心還是SCI,不管是CNS還是低分SCI,不管是灌水還是醞釀大招,不帶個非編碼RNA(noncoding RNA)研究機制在裡面都不好意思投稿,不拉上miRNA感覺故事講不下去,可以編碼蛋白、正經幹活的mRNA被冷落,大家紛紛開始喜歡遍布細胞各處的監工:非編碼RNA(ncRNA)

誠然ncRNA確實成為近些年顏值較高、能來事兒、人見人愛的十大傑青之一,但歸根結底還要和表型聯繫在一起,最終還是要通過蛋白質去實現表觀遺傳的本領,所以發大文章、走上巔峰,除了抱ncRNA的大腿外,蛋白質的分析功夫可不能丟,這不,X濕兄這幾天就在溫故而知新:蛋白質的常規檢測技術。

那麼,我們對蛋白質的哪些特點感興趣呢?

(一)蛋白質的分子量、有無亞基?

(二)蛋白質的序列

(三)蛋白質的功能預測

(四)胞內蛋白質在哪裡工作?胞外蛋白呢?

(五)蛋白質的磷酸化檢測

(六)蛋白質-蛋白質相互作用

(七)蛋白質和DNA、RNA相互作用

(一)蛋白質的分子量、有無亞基

技術:蛋白層析、SDS-PAGE、Native-PAGE

當你發現一個未曾被報道過的蛋白質,想要知道它的分子量大小、有無亞基時,你可以做以下實驗,如血紅蛋白就是四聚體。

1) 天然蛋白的分離:蛋白層析法(這種情況較少)

也稱分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged),下面這個品牌PharmaciaTM大家可以自行搜索一下,在蛋白層析界,那就是一拳超人般的存在,市場份額最大(小張說這是廣告,要刪了,但真不是廣告啊)

2) 重組蛋白的分離:6*HIS標籤、GST蛋白標籤等

想當年X濕兄做了多少次重組蛋白的純化啊,一把辛酸淚呢!

大家都釣過魚吧,重組蛋白就是利用這種原理

1. 池塘:大腸桿菌或哺乳動物細胞被誘導表達後混合物,目的蛋白(target protein)就在其中。

2. 魚餌:能特異性吸附蛋白質頭部或尾部的蛋白標籤(例如HIS組氨酸標籤被鎳離子吸附)

3. 魚竿:層析柱裡面的凝膠填料,固相載體。

(請關注下期微信文章:重組蛋白純化技術)

3) SDS-PAGE:變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳

SDS以及巰基乙醇,讓蛋白質的高級結構完全瓦解,被嚴重蹂躪,變成直線棒狀的蛋白質會在電場的作用下,在PAGE的網孔中穿梭向前跑,那些個頭越小跑得速度越快,個頭越大受到的阻力越大,跑得越慢,那麼該組織或者細胞的蛋白質就會在PAGE的跑道上依次排開,你的蛋白質就可以通過已知的分子量個頭大小進行分析。

4) Native-PAGE:不含SDS、巰基乙醇,蛋白質依然冰清玉潔

非變性凝膠電泳,也稱為天然凝膠電泳,可以使蛋白質保持其天然的形狀和電荷,與變性凝膠電泳最大的區別就在於蛋白在電泳過程中和電泳後都不會變性,所以亞基、高級結構啥的都保留下來。

SDS-PAGE:你大媽已經不是你大媽了!

Native-PAGE:你大爺還是你大爺。

(二)蛋白質的序列

技術:質譜、蛋白質測序

① 打個質譜小試牛刀–性價比高

每種蛋白質氨基酸序列都不同,所以蛋白質被打斷後,產生的肽片段序列也不同,其肽混合物品質數即具一定特徵性。用實測的肽段品質去查找蛋白質和核酸序列庫,結合適當的電腦演算法,可鑒定多肽序列。但這種方法不能用來直接測序,必須依靠大量的資料庫資訊進行比對,這種要比直接蛋白質測序要經濟實惠。

② 蛋白質直接測序–成本很高

自然界中有些化學物質喜歡奪人所愛,霸佔人家媳婦兒,有的喜歡N端的氨基酸殘基,有的喜歡C端的,並巧取豪奪,利用這個原理,特異性地找到流氓,就知道哪個媳婦兒都奪走了,拼接出來完整的蛋白質序列。

(三)蛋白質的功能預測

蛋白質的許多特性可直接從序列上分析獲得,如疏水性,它可以用於預測序列是否跨膜螺旋(transmenbrane helix)或是前導序列(leader sequence)。但是,總的來說,我們根據序列預測蛋白質功能的唯一方法是通過資料庫搜尋,比較該蛋白是否與已知功能的蛋白質相似。

PROSITE(蛋白質家族及結構域資料庫):www.expasy.org/prosite/

PROSITE中涉及的序列模式包括酶的催化位點、配體結合位點、與金屬離子結合的殘基、二硫鍵的半胱氨酸、與小分子或其它蛋白質結合的區域等。

(四)胞內蛋白質在哪裡工作?胞外蛋白呢?

技術:免疫組化(IHC)、免疫熒光技術、ELISA、ELISPOT

1) 免疫組化(IHC):用標記的特異性抗體對組織內抗原的分布進行定位,相信有的同學都做到吐了,看到IHC這幾個字兒都吃不下飯了吧

2) 免疫熒光技術(Immunofluorescence):以熒光物質標記抗體而對細胞中抗原進行定位的技術。

兩者區別:IHC→組織;IF→細胞

3) ELISA、ELISPOT

1.ELISA:相信大家基本都做過,要想了解體液中某個蛋白的濃度,ELISA是首選,但是其不能定位到是哪個細胞分泌的胞外蛋白。

2.ELISPOT:基於ELISA的免疫原理,在體外細胞板孔內培養一群細胞,事先已經固定在板孔內的抗體可以捕捉到細胞生長過程中分泌的目標蛋白,顯色後就能看得出來是哪些細胞分泌的目的蛋白,也就是定位,也可以半定量測定其濃度。

ELISA、ELISPOT技術

(五)蛋白質-蛋白質相互作用

技術:GST pull-down技術、Co-IP、酵母雙雜交技術

1) GST pull-down技術:說白了就是釣魚執法

將探針蛋白與GST(Glutathione S transferase)融合,融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH(Glutathione)親和結合。因此,當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相複合物混合時就可被吸附而分離。

2) Co-IP:Co-Immunoprecipitation

假設一種已知蛋白是某個大的蛋白複合物的組成成員,那麼利用這種蛋白的特異性抗體,就可能將整個蛋白複合物從溶液中「拉」下來(常說的「pull-down」),進而可以用於鑒定這個蛋白複合物中的其他未知成員,例如用WB的方法去鑒定。

A喜歡B,B喜歡C,最後ABC做了一個幸福的Co-IP實驗

3) 酵母雙雜交技術:搭鵲橋,牛郎織女來相會

酵母雙雜交系統基於真核基因轉錄機制。真核生物轉錄因子GAL4含有二個不同的結構域:DNA結合結構域(DNA-binding domain)和轉錄激活結構域(transcription-activating domain)。但是它們兩個分開,後面的基因是無法啟動表達。GAL4 DNA-BD可識別DNA上的特異序列,並使GAL4 AD定位於所啟動的基因的上游, GAL4 AD可同轉錄複合體的其他成分作用。

聰明的某個科研狗就把GAL4 DNA-BD上面安裝上一把鑰匙,GAL4 AD安裝上一把鎖,如上圖所示,只有當他們的鑰匙和鎖是匹配的,GAL4 DNA-BD和GAL4 AD靠近了才能發揮功能,才能夠正常地翻譯目標蛋白。

成千上萬的鎖和鑰匙一個一個試,只有正確匹配的鎖和鑰匙才能讓牛郎和織女相會於鵲橋之上。

(六)蛋白磷酸化檢測-一把車鑰匙

技術有:激酶活性分析、磷酸化抗體Western Blot

蛋白質磷酸化(Protein phosphorylation)是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍,也是最重要的機制。

蛋白質磷酸化主要發生在三種氨基酸上,絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸,因為其結構末端含有羥基,羥基很活潑,可以與磷酸基團結合。磷酸化就像是車鑰匙,磷酸化就一路狂奔,去磷酸化就靠邊停車(當然也有的磷酸化是抑制功能)。

WB大家都做過,可以半定量以及判斷蛋白分子量

(七)蛋白質-核酸互作

技術:EMSA、ChIP、ChIP-CHIP、ChIP-seq、RIP-seq

蛋白和核酸互作,要麼是DNA,要麼是RNA。

那麼蛋白質和DNA在一起能幹什麼呢?原因只有一個:蛋白質和DNA序列結合,是為了調控基因的表達,也就是表觀遺傳學的範疇。

真核生物的基因組DNA以染色質的形式(chromatin)存在。染色質免疫沉澱技術(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前最常用也是最有效的DNA與蛋白質相互作用的研究方法。如下圖所示,用已知目的蛋白的抗體把蛋白-DNA複合物富集起來,拿去測序!

ChIP衍生出了好多應用:

① ChIP與基因晶片相結合建立的ChIP-CHIP方法,得到了高通量篩選;

② ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術,能夠高效地在全基因組範圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。

類似於ChIP,研究RNA和蛋白互作

①RIP技術(RNA Binding Protein Immunoprecipitation),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,能幫助發現miRNA、lncRNA的結合蛋白或者蛋白互作的ncRNA。

②RNA免疫共沉澱測序(RIP-seq),將RIP與二代高通量測序技術結合起來,在基因組範圍內發現與蛋白或蛋白複合物相結合的RNA。

聲明

限於篇幅,僅介紹較常規的技術,如有遺漏,歡迎大家留言補充。