實驗復盤（三）提RNA降解還反轉？
- 2019 年 10 月 29 日
- 筆記
這一次的實驗復盤，想好好總結一下最基本的分子實驗操作——提取RNA反轉成cDNA 應用：可以用於基因表達定量/非定量，比如說RT-PCR，RT-qPCR等等
part 1
簡單說一下我用到該實驗技術的目的： 1，想要檢測一下這個外源導入的基因是不是表達（可以不需要定量，看最後有無PCR條帶就可以） （如果是蛋白表達的話，還可以去做western-blot看看蛋白的表達情況，但是得需要有相應的抗體去體現，如果表達量比較低的話，wb的效果不會很直觀了，而且wb的效果與抗體的效價關係很大。） 2，如果要檢測外源基因的具體表達情況（需要定量，則需要做qPCR） （這個時候需要用內參基因，如actin，GAPDH等去當對照去定量）
這裡需要說一下，RT-PCR和RT-qPCR是不一樣的，RT-PCR的話最終呈現形式是跑膠看有沒有目的條帶，但是RT-qPCR的話是需要去看cq值去定量。
part 2
2.1 關於提取RNA原理方法：
一：試劑盒提取的方法 二：Trizol法 這裡上一個之前用過的提取RNA的protocol : https://medicine.yale.edu/keck/ycga/Images/TRIZOLRNAIsolation_092107_tcm240-21453.pdf
1: Trizol法基本的是Trizol裂解細胞，到氯仿抽提，異丙醇沉澱，再用75%的乙醇洗，最後晾乾加DEPC水溶解。 2: 有些試劑盒也是利用Trizol的原理去提RNA，但是不同的裂解buffer可能會不同，萬變不離其宗 3：試劑盒的話，仔細閱讀說明書，有些組分得自己備好，現配現用
2.2 關於提取RNA的注意事項：
1：戴好手套，口罩，穿好實驗服，因為人體自帶核酸降解酶 2：用RNAase free的槍頭 3：檯子和移液槍提前用酒精噴一遍，保持檯面乾淨 4：一定要確定溶RNA的水沒有問題！！！！！首推DEPC水！！！！！ （RNA降解的速度是非常的快的。。。。。。）
提過RNA的童鞋都知道，好的RNA跑膠一般是可以看到3條帶的，分別是28S,18S,5S，但是如果RNA降解里的話是看不清楚的。條帶「糊」掉 （PS：跑膠前把電泳槽里的液體換掉，還有可以跑快一點，電壓調高，防止跑膠過程中RNA降解的太快） 上一張正常的RNA跑膠圖：
正常RNA跑膠圖
再上一張殘忍的翻車圖：
RNA降解情況
part 3 還能反轉？
一般來說，大家都是重做了，但是我的樣品太特殊了，重做代價很大，硬著頭皮反轉了，結果證明還是可以的（基於上面降解的PCR圖情況），但是還是和實驗目的有關係，如果是做qPCR的話成功的概率比較大，如果要P片段比較長的PCR的話，成功概率會降低一些。
策略： 1：加大RNA反轉的起始量 2：加入oligdT+隨機引物一起反轉 3：延長反轉的時間 4：稍微提高反轉的溫度（看反轉的酶的情況，我試過50℃反轉）
第一點，我是用4ug的RNA做的反轉（看試劑的最大量情況，有的試劑盒反轉起始量最多1ug，有的5ug，針對這種RNA降解的情況，肯定得多加一點）
第二點，如果是看錶達的話，一般會用oligdT，然後長的反轉時間（45-50min）,這種是看基因表達的情況，但是如果RNA降解的厲害不推薦，因為親測，反轉後PCR是一片smear！
oligdT+隨機引物： 隨機引物它對RNA模板不同區域沒有偏好性。兩種引物都加，目標mRNA的反轉錄的cDNA是更容易獲得能擴增出目的片段的引物模板 因為oligo dT引物針對的事RNA里的mRNA，而隨機引物是針對所有RNA模板，這樣兩種引物逆轉錄所產生的cDNA量不一樣。針對qPCR來說，本質是不求長，求多啊
反轉時 37℃換成50℃可以提高cDNA的量（這個得看翻轉酶，有必要可以問一下技術支援確認）
最後上一張PCR結果圖，還是可以P出來的！
RT-PCR結果
敲重點！！RNA發生降解，會影響qPCR的Ct值，即使使用內參基因校正，依舊會造成定量結果出現誤差，不能精確反應樣本間的基因表達量的差異。Fleige S等人做過實驗，RNA的降解對於基因的定量差別很大。（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16900335）
感覺還是挺幸運的，提取RNA雖然簡單，但是也得小心和注意！ 祝大家好運呀！
Ref: 1: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16900335
