類器官：腫瘤研究的新高地

• 2019 年 10 月 6 日
• 筆記

科研貓

每年腫瘤相關研究的學術論文發表量數以萬計，但能真正轉化到臨床應用的治療方案卻極少。新葯研發進入臨床試驗後，有85%在早期就被證明沒有效果，而那些成功通過三期臨床試驗的藥物，只有一半能被FDA批准進入臨床使用。腫瘤新葯研發所用生物模型的落後，是導致新葯研發成功率低的重要原因，腫瘤類器官不僅可以保留腫瘤的異質性，還可以模擬腫瘤微環境，它的出現將使腫瘤機制研究和藥物研發突飛猛進。。

腫瘤

抗生素和疫苗發現以前，傳染性疾病曾肆虐全球，是人類健康的頭號殺手。而現今，非傳染性疾病已然成為健康問題的主要影響因素，如糖尿病、癌症和心臟病，整體佔全世界死亡人數的70%以上（4100萬人），數據來自WHO2019年《第十三個工作總規劃》，參見科研貓公眾號往期熱文 2019年全球衛生健康十大威脅–WHO 。

其中，腫瘤更是首要致死原因。最新統計學數據預測，2018年將有超過1800萬新增腫瘤病例，960萬腫瘤死亡病例[1]，腫瘤所造成的巨大經濟、社會負擔毋庸置疑。

人類與腫瘤的鬥爭歷史源遠流長。從希波克拉底時代開始，就有對腫瘤的描述性研究，包括其生長形態、表面潰爛的形成與否等，腫瘤（carcinoma/carcinos）在希臘語是螃蟹（crab）的意思，由此，羅馬醫生將carcinoma/carcinos翻譯為cancer，成為癌症的最初定義。

近年來，隨着理論和技術的飛速發展，包括「腫瘤是不可癒合的創口」、「種子與土壤學說」、「腫瘤免疫互作四部曲」、「腫瘤放射化學藥物療法」、「腫瘤免疫治療」等，我們對腫瘤的認識日漸深入，部分腫瘤甚至已經有了完全治癒的方法。

但目前對絕大多數腫瘤，我們一方面沒有有效的預防和監測手段，另一方面可以選擇的治療策略極其有限。因此，對腫瘤的研究一直是生物醫藥領域的核心熱點。

有意思的是，每年腫瘤相關研究的學術論文發表量數以萬計，絕大多數腫瘤在實驗室已經得到了成百上千次治癒，但能真正轉化到臨床應用的治療方案卻極少。美國食品與藥品監管局統計發現，臨床前研究具有治療作用的新葯進入臨床試驗後，85%在早期就被證明沒有效果，而那些成功通過三期臨床試驗的藥物，只有一半能被FDA批准進入臨床應用[2]。

腫瘤模型

目前腫瘤新葯研究的主要工具是體外培養的腫瘤細胞和嚙齒類動物（主要是小鼠）上建立的腫瘤模型，但越來越多的證據表明，小鼠與人在疾病過程中的變化及其對藥物的反應性存在一定的差異[3]。此外，小鼠模型通常只能模擬人類疾病的一個階段，無法從病因、時間和進展速度等方面再現人腫瘤發生髮展的全過程，在此基礎上開發的腫瘤治療方案，並不能預測其臨床應用的有效性。更重要的是，實驗小鼠基因背景、生長環境、致病因素和用藥處理均非常單一，自然無法應對臨床多種多樣腫瘤病人的複雜情況。

動物模型的局限性促使人們轉向直接研究腫瘤病人標本，常用的人源腫瘤模型包括人來源腫瘤細胞系培養和免疫缺陷動物人源腫瘤組織異種移植。腫瘤細胞培養的確提供了研究特定患者腫瘤細胞特性及其對藥物敏感性的機會，但並非所有腫瘤均能成功體外擴增，另外，體外單一腫瘤細胞培養使其喪失了與腫瘤微環境中其他組分的相互作用，而腫瘤微環境對腫瘤的發生髮展以及對藥物的反應性決定至關重要。同樣，人源腫瘤組織異種移植至免疫缺陷小鼠中也存在類似的問題，一方面移植成功率較低，另一方面免疫缺陷小鼠形成的腫瘤微環境與患者體內環境相差較大，可能導致腫瘤組織發生小鼠樣進化[4]。

類器官

近年來，組織器官3D培養技術發展迅猛。2009年，Hans Clevers實驗室將單個LGR5+小腸幹細胞種植於含有R-spondin1、EGF、BMP抑製劑等幹細胞維持因子的基質膠中，發現幹細胞增殖分化，形成了具有增殖隱窩和高分化絨毛的類小腸結構[5]。隨後，該實驗室在小鼠小腸幹細胞成類器官技術的基礎上，進一步加入Wnt3A nicotinamide、Alk抑製劑及p38抑製劑，實現了人結直腸腫瘤類器官培養[6]。

同年，Eduard Batlle實驗室分離出人大腸EPHB2高表達幹細胞，並在體外3D培養中使單個細胞分化成為具有維持長期自我更新和多向分化潛能的大腸隱窩結構[7]。隨後，包括前列腺[8, 9]、味蕾[10]、食管[11]、輸卵管[12]、肝臟[13]、胰腺[14]、胃[15]、唾液腺[16]和乳腺[17]等在內的多個器官均成功在體外獲得正常組織或腫瘤的類器官（如圖）。科研貓公眾號 Nature：有史以來「最逼真」糖尿病血管病變模型的建立 一文，是2019年最新發表在《Nature》上的有關糖尿病血管病變類器官模型的建立。

圖： 腫瘤組織類器官發展歷程。二十世紀六十年代到八十年代，3D培養已經成為生物學研究的熱點，當時利用3D培養技術主要是在體外模擬組織器官生成的過程，將胚胎幹細胞分化培養成微型器官，藉以研究器官發育的發生機制。從2009年Clevers實驗室第一次用成體幹細胞，即小腸幹細胞培育出具備小腸絨毛和隱窩結構的類器官以來，組織類器官培養再次成為明星技術，2013年和2017年分別被Science和Nature Methods雜誌評為年度十大進展和突破。從實驗動物到人樣本，從組織幹細胞分化培養到直接組織培養，從單一細胞結構到多種細胞基質的加入，組織類器官從發育生物學研究工具變成腫瘤研究的利器。

由此可見，利用目前對腫瘤細胞和腫瘤微環境相互作用機制的認識，從腫瘤病人樣本出發，通過加入多種細胞因子或小分子抑製劑，構建出患者特異性的腫瘤類器官，用於新葯篩選和藥物敏感性研究是可行的。

腫瘤類器官

相比於傳統2D培養和腫瘤組織異種移植，腫瘤類器官一方面構建成功率明顯增高，且可長期低成本快速培養，便於基因修飾和大規模藥物篩選等；另一方面，3D培養保留了腫瘤的組織特性，在研究過程中不會丟失腫瘤微環境的影響作用，為腫瘤藥物研發提供更真實的環境。目前已經成功構建出包括結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌等在內多種組織的腫瘤類器官。

常用的腫瘤類器官構建技術有兩類，一種是通過誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）分化而來，另一種是直接來源於腫瘤組織。iPSCs來源的腫瘤類器官構建成功與否很大程度上依賴於腫瘤類型，操作更複雜，由此導致構建效率較低。此外，依靠iPSCs分化獲得的腫瘤類器官也會丟失腫瘤微環境的複雜性。因此，直接通過腫瘤組織培養或幹細胞分化，輔以細胞因子、腫瘤基質等補充，是腫瘤類器官研究的發展趨勢。

腫瘤類器官對源腫瘤組織異質性的保存是類器官研究的核心基礎。研究發現，腫瘤組織體外類器官培養可以獲得大量不同特性的腫瘤類器官，單個類器官分析結果也表明同一腫瘤來源的類器官的異質性[18]。與此同時，組織化學分析發現腫瘤類器官內部即存在與源腫瘤相似的組織結構，通過原位DNA分析進一步證實類器官中同樣存在源腫瘤相同的基因突變位點[18]。由此可見，腫瘤類器官在基因、轉錄、代謝、細胞和組織學上均較高水平地重現了其來源腫瘤的多樣性和複雜性。更重要的是，體外培養過程對腫瘤類器官不會呈現明顯均一化[19, 20]。

但也有研究利用熒光標記不同突變體實驗發現，大腸癌腫瘤類器官體外培養30-40天後，類器官會被某一種熒光標記的細胞主導，意味着培養過程中的確出現了特定突變體細胞優勢生存的現象[21]。但這一現象並非體外類器官培養所獨有，在體腫瘤中各類突變體也非均勻分佈。由此說明腫瘤類器官確實在很大程度上模擬了在體腫瘤的各方面特性，是目前腫瘤基礎研究和臨床應用之間相互轉換跨越的橋樑。

腫瘤的發生初始於細胞基因突變的累積，大量臨床數據和實驗室結果都顯示正常個體內即存在大量的突變，且這些突變與年齡、生存環境、生活方式等均有一定的相關性，但並非所有的突變都會誘發腫瘤，不同組織對突變的耐受程度也不同。雖然已經有許多細胞和動物實驗闡明從突變到腫瘤生成的關鍵因素和決定機制，由於無法監測和干預人體內腫瘤發展最初期的過程，目前對人體內腫瘤發生髮展的認識還非常粗淺。類器官培養技術的興起，為研究人體正常組織向腫瘤組織轉變的過程提供了可能。

腫瘤治療是目前生物醫學領域最大、最急迫的難題之一。一方面實驗室研究越來越多，另一方面新葯臨床轉化效率卻依然低下。類器官培養為腫瘤藥物快速有效研發提供了新的技術平台。有研究認為腫瘤類器官敏感的藥物超過80%的可能性對應的腫瘤患者對該葯也敏感，而在腫瘤類器官上無治療效果的化療藥物對該腫瘤患者也無效。

隨着類器官培養技術的迅速發展，越來越多的實驗室和醫院開始有意識地採集腫瘤類器官及其對應的健康組織類器官，並運用合適的凍存傳代方法進行大規模保存，形成類器官庫。18年5月，Cell雜誌上發表了世界首個癌症類器官生物銀行[17]。根據患者信息、組織來源、基因表型等多個方面對類器官進行歸類，使之成為公共的腫瘤研究資源，用於評測抗腫瘤藥物的腫瘤殺傷效果和正常組織毒副作用。

更多有關類器官在腫瘤機制研究和治療策略中的應用，見後續更新。

參考文獻

1. Bray, F., et al., Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018.

2. Ledford, H., Translational research: 4 ways to fix the clinical trial. Nature, 2011. 477(7366): p. 526-8.

3. Uhl, E.W. and N.J. Warner, Mouse Models as Predictors of Human Responses: Evolutionary Medicine. Curr Pathobiol Rep, 2015. 3(3): p. 219-223.

4.Ben-David, U., et al., Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nat Genet, 2017. 49(11): p. 1567-1575.

5.Sato, T., et al., Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature, 2009. 459(7244): p. 262-5.

6. Sato, T., et al., Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology, 2011. 141(5): p. 1762-72.

7. Jung, P., et al., Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med, 2011. 17(10): p. 1225-7.

8. Karthaus, W.R., et al., Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell, 2014. 159(1): p. 163-175.

9. Chua, C.W., et al., Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol, 2014. 16(10): p. 951-61, 1-4.

10.Ren, W., et al., Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(46): p. 16401-6.

11.DeWard, A.D., J. Cramer, and E. Lagasse, Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep, 2014. 9(2): p. 701-11.

12.Kessler, M., et al., The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun, 2015. 6: p. 8989.

13.Huch, M., et al., Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell, 2015. 160(1-2): p. 299-312.

14.Boj, S.F., et al., Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell, 2015. 160(1-2): p. 324-38.

15.Bartfeld, S., et al., In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology, 2015. 148(1): p. 126-136 e6.

16.Maimets, M., et al., Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports, 2016. 6(1): p. 150-62.

17. Sachs, N., et al., A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell, 2018. 172(1-2): p. 373-386 e10.

18. van de Wetering, M., et al., Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 2015. 161(4): p. 933-45.

19.Pauli, C., et al., Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discov, 2017. 7(5): p. 462-477.

20. Schutte, M., et al., Molecular dissection of colorectal cancer in pre-clinical models identifies biomarkers predicting sensitivity to EGFR inhibitors. Nat Commun, 2017. 8: p. 14262.

21.Fujii, M., et al., A Colorectal Tumor Organoid Library Demonstrates Progressive Loss of Niche Factor Requirements during Tumorigenesis. Cell Stem Cell, 2016. 18(6): p. 827-38.

本文原創作者：LepR

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