10x單細胞測序技術揭示肝臟細胞全景圖

  • 2020 年 3 月 30 日
  • 筆記

吶，等你關注都等出蜘蛛網了~

不知不覺在單細胞轉錄組領域做知識分析也快兩年了，很幸運聚集了五個小夥伴攜手共進，我們承諾不間斷更新5個月，把我們這兩年的學習成果全部掏出來給大家，包括5個欄目：

  1. 文獻速遞（簡短介紹，擴充知識面）
  2. 文獻詳解（圖文並茂帶來大家系統性學習）
  3. ř與Bioconductor的技巧（書籍翻譯，妙招共享）
  4. scRNAseq的GitHub的書籍翻譯（原汁原味的名校教程）
  5. 全網第一個單細胞轉錄組視頻教程學習筆記分享

現在你看到的是文獻速遞

希望大家能有所收穫！

文章信息

今天給大家介紹的文獻發表於2018年10月的Nature Communication上，題目是：「Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations」 ，是關於單細胞測序在發育研究中的應用。

文章總覽

肝臟是人體內最大的實體器官，對代謝和免疫功能至關重要。然而人們對構成人體肝臟的細胞類型和免疫微環境知之甚少。作者使用10x單細胞RNA測序手段繪製了人類肝臟細胞全景圖，從來自五個人新鮮肝臟組織中分離得到的8444個實質和非實質細胞轉錄譜。通過鑒定每群細胞的差異表達基因（DEG），並使用已知的標誌性基因、流式細胞術以及人肝組織的免疫組織化學染色技術，作者鑒定到了20個離散的細胞群，包括肝細胞、內皮細胞、膽管細胞、肝星狀細胞、B細胞、常規和非常規T細胞、NK樣細胞和不同的肝內單核細胞/巨噬細胞群，兩個不同的駐留巨噬細胞群具有炎性和非炎性/免疫調節功能，這些結果揭示了肝臟免疫生物學特性。

背景知識

肝臟對人體新陳代謝和免疫功能至關重要。單細胞分辨率的健康人肝臟細胞全景圖對於理解肝病的發病機制和治療至關重要。但是這種全景信息很難獲得，主要是因為新鮮的人體肝臟組織很難獲得，組織很難分割，其中一些脆弱的常駐細胞群很容易被破壞。因此本文一是應用作者以前開發的肝臟組織解離技術來分離肝臟組織，二是使用單細胞轉錄組測序技術（scRNA-seq），結合兩者來繪製正常人肝臟細胞全景圖。scRNA-seq技術是描述高度異質性細胞群體的有力工具，但是該技術尚未被廣泛使用於繪製整個人體器官圖譜。

樣本

神經死亡的五個捐贈者正常肝臟組織

10x樣品處理和cDNA文庫製備

將組織破碎獲得懸浮細胞溶液後，用台盼藍染色計數檢測細胞活率，在49-90%範圍，使用10x Genomics Single Cell 3′ v2 Reagent Kit建庫，預計捕獲6000個細胞，反轉、擴增、純化，最後檢測濃度。作者都是按10x官方推薦的條件進行操作的。測序平台採用的是Illumina HiSeq 2500。

數據處理：細胞群聚類、分析表達差異基因、通路富集

原始bcl文件用Illumina bcl2fastq軟件轉換為fastq文件，並且與人基因組序列進行比對。用10x官方的CellRanger產生表達矩陣，接着用R包進行過濾、歸一化、聚類。歸一化後用另一個常用10x數據分析常用包Seurat進行聚類，包括PCA和t-SNE，還用Seurat做了細胞周期時相預測。基因集富集分析（GSEA）用來分析特定基因群在通路的富集。基因集變異分析（GSVA）用來分析基因簇在活躍細胞通路。在Cytoscape 中高度相關性的通路用AutoAnnotate歸類並定義。作者還對檢測到的基因進行了人/鼠相關性分析。

結果

經過過濾，每個樣本的細胞數範圍從1073到3255個； 平均一個文庫檢測到的UMI為5227（範圍3122-6043 UMI）；每個細胞檢測到的平均基因數為1313（範圍906-1537基因）。過濾器閾值通常設定為10％，但是肝細胞線粒體含量很高，因此作者選擇了閾值為50％，以優化保留肝細胞而去除死亡和垂死的細胞。作者還過濾除去了雙核細胞。

正常人肝臟細胞全景圖

肝臟的主要「構建塊」是肝小葉。 肝小葉包括門靜脈三聯體（肝動脈，門靜脈和膽管），肝細胞排列在毛細血管網和中央靜脈之間。在肝竇之間發現的是實質細胞（肝細胞）和非實質細胞（內皮細胞，膽管細胞，巨噬細胞，肝星狀細胞和肝臟浸潤淋巴細胞（包括B細胞，αβ和γδ，T細胞和NK細胞））。

定義細胞群

將所有捐贈者的細胞彙集起來，濾掉活力低的細胞後，共計捕獲了8444個細胞，在無監督聚類t-SNE圖中這些細胞聚集成了20個群體。用肝細胞/免疫細胞的已知基因表達譜進行熱圖分析。 通過將每群細胞的表達譜與已建立的肝細胞，內皮細胞，膽管細胞和免疫細胞的細胞特異性標記基因表達相匹配來指定每個細胞群的身份。

肝細胞亞群

作者發現六種不同的肝細胞群體，包括細胞群1,3,5,6,14和15，其中增殖細胞比較少。肝細胞的標誌基因ALB(Albumin) , HAMP, ARG1，PCK1, AFP, BCHE 。

活躍細胞通路分析

為了研究不同細胞群的功能，作者用通路分析來鑒定每群活躍細胞通路。1區門靜脈周圍肝細胞在糖異生和β-氧化中具有已知的作用。 通路分析顯示，Cluster 5富含肝臟門靜脈功能的特徵性途徑，包括膽固醇和甾醇生物合成以及許多活躍的免疫途徑。

兩個不同的人肝巨噬細胞群

作者研究的一個重要發現是存在兩個不同的人肝巨噬細胞群，似乎能夠分為促炎和免疫調節兩種表型，例如MARCO這一標誌僅在非炎性KCs細胞中表達。使用流式細胞儀觀察到了一個亞群巨噬細胞表面表達MARCO marker。免疫組化的結果表明MARCO陽性細胞的分佈集中在門靜脈區域。MARCO+ 巨噬細胞響應LPS / IFN-γ的刺激而分泌的TNF-α少於CD68 + MARCO- 巨噬細胞，表明CD68 + MARCO-細胞更具促炎性。MARCO在腫瘤微環境中的表達與人乳腺癌的較差結果有關。MARCO也在臨床前小鼠結腸癌模型中進行了檢查，觀察到MARCO的表達定義了抑制性腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的亞型。 這些TAMs可以通過抗MARCO抗體極化為炎症表型，促進了腫瘤免疫原性。 這些發現為檢查肝內單核細胞/巨噬細胞亞群在肝病的建立和進展中的作用提供了參考。

總結

阻礙人體肝臟研究的一個關鍵問題是難以獲取及分離新鮮組織樣本。而基於單細胞基因組學的研究肝臟組織可以在有限的樣本中充分獲取無偏信息，許多個體細胞群的貢獻就可以被發現。以前有過小鼠肝臟圖譜的研究，而現在人肝臟轉錄圖譜則又向前發展了一大步，對研究微環境及肝功能和疾病提供了支持。

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