單細胞大樣本也不好發出去了

2020 年 3 月 30 日
筆記

2013年，《Nature Methods》雜誌將單細胞測序列為年度技術。
2013年，《Science》雜誌將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首。 與此同時，隨着測序成本的下降，越來越多的單細胞的文章發表在頂級的期刊上，這些都表明單細胞測序已經成為科研的熱點。但是並不意味着沖向這個領域就有CNS，哪怕花了幾百萬經費測大量單細胞轉錄組數據。尤其是某些癌症領域，已經有了幾十個單細胞相關研究發表，如果確實從實驗設計和數據角度來看都平淡無奇，那麼很可能大量單細胞的轉錄組數據也不是很好發出去。

從摘要到預印本

比如，有一個研究團隊（BGI-Shenzhen）做的是乳腺癌領域的三陰性乳腺癌的單細胞免疫微環境研究：

首先是2018摘要：https://cancerres.aacrjournals.org/content/78/13_Supplement/1763A 上面公布了研究者測了8個TNBC病人的七千多個單細胞，如下：

we performed deep single cell RNA sequencing to 7,066 immune cells collected from 8 TNBC patients using the MIRALCS platform. We identified 13 immune cell subsets according to their transcriptome features. We found that the frequency of identified T cells and macrophages varied greatly across patients.

結論居然僅僅是不同免疫細胞亞群在不同病人的比例差異很大！所以只能是一個摘要。

然後研究團隊把之前的8個TNBC病人隊列擴大到了14個病人，細胞數量也由之前的七千多到接近一萬個。但仍然是丟在2019年5月的預印本：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/566968v1

Here we report single-cell RNA sequencing results of 9683 tumor-infiltrated immune cells isolated from 14 treatment naïve TNBC tumors, where 22 immune cell subsets

這次的免疫細胞亞群更多了，如下：

可以看到腫瘤病人的免疫細胞其實是沒有病人特異性的，不同病人的免疫細胞會很好的混在一起，但是會依照免疫細胞的亞群來區分，僅僅是T細胞就有9個亞群，每個亞群特有的高表達量基因是：

而且有一個評價很有意思。感興趣的可以直接去https://www.biorxiv.org/content/10.1101/566968v1圍觀哈。

仍然是停留在細胞分群以及亞群注釋階段，其實就是我們一直講解的R包及基礎流程，分別是: scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop 需要熟練掌握它們的對象，：一些單細胞轉錄組R包的對象流程也大同小異：

step1: 創建對象
step2: 質量控制
step3: 表達量的標準化和歸一化
step4: 去除干擾因素(多個樣本整合)
step5: 判斷重要的基因
step6: 多種降維算法
step7: 可視化降維結果
step8: 多種聚類算法
step9: 聚類後找每個細胞亞群的標誌基因
step10: 繼續分類

其中一個步驟是判斷重要的基因，我分享過：比較5種scRNA鑒定HVGs方法裏面就提到了。

這不是深圳華大基因第一次丟單細胞轉錄組數據在預印本了

BGI-Shenzhen團隊之前也有一個牽頭的乳腺癌的10X單細胞轉錄組測序項目，題目是：Comprehensive analysis of immune evasion in breast cancer by single-cell RNA-seq

關注的是乳腺癌病人的腫瘤微環境 的細胞類型，尤其是免疫細胞如何作用於癌症細胞。鏈接是：. doi: http://dx.doi.org/10.1101/368605 bioRxiv preprint first posted online Jul. 13, 2018; 研究納入了 15個病人，總共五萬多單細胞，是商業的10x技術。

luminal A (P01, 5 P02, P03, P04, P05, P06, P07A, P07B and P08)
luminal B (P09 and P10)
HER2+ (P11 and P12)
TNBC (P13, P14 and P15). 單細胞建庫是：Chromium Single-Cell Instrument (10X Genomics) to generate single-cell gel bead-in-emulsions (GEMs). 有趣的是測序階段使用的是 BGIS EQ-500 。同時做了少量的wgs和wes數據，使用的也是 BGIseq Human Exome V4 Kit (BGI) 自己的wes捕獲芯片。

補充知識

為什麼我會搜索到這兩個預印本的單細胞轉錄組研究呢，其實是因為我恰好看到了MIRALCS系統，在這個系統上可以完成細胞的分離及擴增，從而減少了操作誤差，實驗的可靠性更高和平行性更好

此方法學的文章： Wu et al. Full-length single-cell RNA-seq applied to a viral human cancer: applications to HPV expression and splicing analysis in HeLa S3 cells. GigaScience (2015) 4:51.

當然了，大家熟知的4種單細胞分離的技術，其實是：

激光顯微捕獲切割技術（LCM）
口吸管分離技術
流式細胞分離技術(FACS)
免疫磁珠分離技術(MACS)