溶酶體神經輕鏈基因表達的皮質網絡與口吃皮質網絡相交

  • 2020 年 2 月 24 日
  • 筆記

持續性發展性口吃是一種言語障礙,其特徵是言語表達流利性受到干擾,這種障礙在兒童早期(集中於2-4歲)出現。口吃的發病率和患病率因年齡組而異,但是從所有年齡階段的發病率看,以往研究認為在5%左右,但最近的調查給出了更高的數字,從5%到18%。在最近的文獻中,通過流行病學調查和綜述分析,患病率大約1%。口吃的主要癥狀包括正常流暢性話語的中斷和說話的斷斷續續模式。重複出現下列情況:聲音和音節重複、聲音延長、感嘆詞、斷句、沉默停頓、繞口令、伴隨身體緊張的言語和/或單音節整詞重複。口吃給發展性口吃者帶來了許多生活困難,並且嚴重影響了他們的生活質量和受教育機會。因此,對口吃的研究從很早就已經開始。

但即使至今,其神經生物學基礎尚不清楚,這其中最主要的原因是口吃的成因可能涉及許多方面。雖然這一領域的最新發展已經使研究人員能夠確定幾種與口吃有關的基因圖譜,但這些特定的遺傳背景是如何影響神經迴路的,以及它們是如何產生或促進口吃語言的出現的,這些都是未知的。

為此,來自麻省總醫院和哈佛醫學院的研究者進行了一項堪稱「大海撈針」式的研究。在這項研究中,作者使用功能連接方法和圖論確定了具有口吃特徵的大規模皮層網絡。通過一項空間相似性分析,檢查了口吃皮質網絡的拓撲結構是否與先前報道的來自Allen人腦圖譜蛋白質編碼轉錄組數據的口吃基因的遺傳表達水平相交叉。

研究結果發現,參與甘露醇-6-磷酸溶酶體靶向途徑的GNPTG基因與口吃皮質網絡顯著共定位。富集(enrichment analysis)分析表明,與口吃皮層網絡相關的基因在神經絲細胞骨架組織中具有明顯的過度表達的生物學功能。通過比較GNPTG和本研究涉及的神經絲基因之間的遺傳相互作用,研究了溶酶體代謝途徑、細胞骨架組織和口吃之間的關係。結果發現,包括CDK5、SNCA和ACTB在內的內酯酶體網絡基因在溶酶體和神經輕鏈基因之間起着功能連接的作用。該研究發表在Progress in Neurobiology雜誌。

這些發現支持了口吃是由溶酶體功能障礙引起的觀點,溶酶體功能障礙對語言神經元迴路的神經絲組織有有害影響。它們有助於闡明溶酶體突變和口吃之間有趣的、尚未解決的聯繫。

基本知識提前了解:

神經輕鏈蛋白(Neurofilaments,NF):構成神經元軸突中間纖維的特異性分子蛋白,是神經元細胞骨架的重要成分,主要定位在成熟神經元的胞體和突起中,負責軸漿運輸,維持神經元正常形態及保持神經纖維的彈性,防止斷裂,典型的神經絲纖維長10nm,可增加軸突的直徑,提高軸突的脈衝傳導速度,其在軸突中呈平行排列,在胞體中則是隨機的,在軸突的運輸過程中神經絲蛋白會發生磷酸化與去磷酸化,以此進行自我更新,表明磷酸化對神經絲的生理功能有重要影響。

細胞骨架(英語:Cytoskeleton):一般是指細胞內細胞質中的由蛋白質構成的纖維的網絡結構。它是一個動態結構,其中有一部分是不斷的被破壞,更新或新建的。

在生命的所有生物領域(古菌,細菌,真核生物)的細胞里都有細胞骨架被發現(特別是在所有真核細胞,包括人類,動物和植物細胞,甚至於噬菌體中都有細胞骨架被發現)。不同生物體的細胞骨架系統是由相似的蛋白質組成。但是,細胞骨架的結構,功能和動態行為可以是非常不同的,這取決於生物體和細胞類型。類似地,在同一細胞類型內細胞骨架的結構,動態行為和功能可以通過與其他蛋白質和網絡的以前的歷史關聯發生變化。

溶酶體(lysosome):為細胞漿內由單層脂蛋白膜包繞的內含一系列酸性水解酶的小體。溶酶體是細胞內具有單層膜囊狀結構的細胞器,溶酶體內含有許多種水解酶類,能夠分解很多種物質,溶酶體被比喻為細胞內的「酶倉庫」「消化系統」。

常染色體遺傳純和(autosomalrecessive disorder):致病基因在常染色體上,基因性狀是隱性的,即只有純合子時才顯示病狀。此種遺傳病父母雙方均為致病基因攜帶者,故多見於近親婚配者的子女。

研究背景:

關於口吃的病因有各種各樣的理論和治療假設。最初,臨床醫生尋找焦慮和口吃之間的關係。因此,一些研究人員深入探討了口吃作為精神疾病原因的可能性。隨着神經影像學技術的出現,神經解剖學因素和大腦連接的發現引起了研究範式的轉變,例如,大量研究發現,口吃與許多區域的灰質變化有關,包括:輔助運動區(SMA)、初級運動區、額下回、島蓋部(Brodmann區[BA] 44)、經典的布洛卡和韋尼克區、顳上回、中央下區(BA43)、島葉、楔前葉、基底神經節-丘腦-皮層環、小腦等。最近的研究還發現口吃與與默認網絡的功能異常以及與支配額葉和頂葉運動區域、聽覺和邊緣腦區的軸突束的變化有關。

除此以外,關於口吃的成因的基因方面的研究也大量出現。已有許多研究發現,語言發育與FOXP2、ROBO1、CNTNAP2、KIAA0319、DCDC2、SLC6A3/DAT、DRD2、AP4E1、ELKS/ERC1等基因的遺傳表達有關,這些基因的突變與發展性言語障礙、特異性語言障礙、閱讀障礙、言語聲音障礙、注意缺陷多動障礙等相關。重要的是,最近的研究突破表明,GNPTAB、GNPTG和NAGPA中的特定遺傳變異都與細胞的溶酶體過程有關,已有發現導致II型和III型常染色體隱性純合子突變的溶酶體過程與口吃病例特別相關。總的來說,口吃的基礎可能涉及特定遺傳背景(如溶酶體代謝途徑)和大腦連接改變之間的關鍵交叉。然而,口吃相關基因是如何影響這些神經迴路從而產生口吃語言的,目前還沒有完全弄清楚。

基於以上問題,本文的研究有兩個目標。首先,使用功能連接和基於圖論的新方法來描述描述口吃(PWS)患者的大規模皮層網絡。其次,使用先前報道的口吃相關基因集,即Allen人腦圖譜(AHBA;(Shen et al., 2012),進行遺傳富集和相互作用分析。作者假設,定義口吃網絡的連通性特徵與基因表達水平的網絡可以共同定位,這些基因表達水平在言語產生過程中會造成神經功能障礙的風險和脆弱性。換句話說,作者假設形成口吃的大腦網絡和某些基因的拓撲分佈之間存在高度重疊,這可能是口吃者大腦迴路缺陷的一個可能原因。總的來說,回答這些問題可能有助於彌補在理解溶酶體代謝途徑和大腦連接改變之間的關係。

研究方法:

本文的研究使用了很多的分析方法,並且不同方法之間存在着很強的邏輯關係。因此,我們先梳理一下作者使用的方法以及使用該方法的目的,然後再介紹下作者是如何使用的。

首先,根據作者的研究問題一,需要確定支持口吃的功能網絡,因此,作者使用了ALE-meta analysis通過以往的研究來確定支持口吃的神經底物。作者使用的是GingerALE 2.3.6工具包,使用了activationlikelihood estimate的方法來分析以往的口吃研究中出現的口吃者腦功能異常的區域。包含的文章包括了使用「stutter+task+fMRI」和「stutter+task+PET」搜索出的PubMed和Web of Science(2017年1月)中的研究。

入選標準包括:

(i)發表在同行評審的科學雜誌上;

(ii)使用功能磁共振成像或PET技術來測量激活;

(Ⅲ)PWS組與NFC組的任務激活情況比較;

(iv)在標準立體定位空間(無論是Talairach還是MNI)報告了基於坐標的數據。同時,作者剔除了個案研究的結果。

同時,為了能夠滿足對與口吃相關的候選腦區的探索性分析,作者在GingerALE中使用了p < 0.001的寬鬆閾值,未做校正。

接着,在確定了一些腦區後,作者需要通過真實的數據集來測試通過ALE薈萃分析得出的腦區所構建的功能腦網絡是否能夠表徵口吃表現。作者使用了這樣幾個數據集: 1.健康成年人數據集(n=100來自大腦基因組超結構項目(Holmes et al., 2015);平均年齡21.2歲;男性51%;右利手);

2.兒童發育性口吃數據集(N=31;平均年齡6.45歲;男性52%;

3.與兒童口吃樣本匹配的兩個對照樣本(n=39和n=24;平均年齡6.24歲;41%的男性)。這些被試的數據採集參數和預處理過程都是標準的,在補充材料里相當詳細,這裡為了節約篇幅,就不贅述了,感興趣的朋友可以添加微信siyingyxf19962074063獲取。

在確定好了口吃腦網絡(ALEmeta分析結果,如圖1的I中的a、b、c三個區域)的種子點以及準備好用於構建網絡的數據後,接下來就需要構建腦網絡了。作者第一步先計算了所有收集到的被試的靜息態數據的灰質mask內的voxel-voxe的功能連接(pearson相關),使用FDR校正功能連接結果(閾值為0.001)。接着,作者將兩種互補的圖論方法應用到剛才建立起的全腦關聯矩陣中,重點放在元分析中確定的感興趣區。第一種方法是通過剛剛建立的全腦矩陣確定和作者在ALE分析中確定的口吃相關腦區中的體素存在顯著關聯的腦區,只要存在關聯就代表與口吃腦網絡有關(也就是圖1中的strategy1)。第二種方法是利用這個全腦相關網絡確定所有其他體素與口吃相關腦區的連接程度,與a、b、c這三個區域中的體素都存在功能連接,那麼這個體素就標值為1,也就是圖1中strategy2的3/3,與兩個區域存在關聯就標值為2/3,與一個區域存在功能連接就標值為1/3。作者這裡其實利用的是圖論中的度值的計算方法,作者用一個公式來表達了每個體素的加權值的計算方法:

WD代表weighted degree,即度值,使用體素i連接到目標區域S(s從1開始)的FC的功能連接顯著的值進行加和,加和次數為m(a、b、c這三個區域,即把三個區域的連接可能性都加上)。這樣算出來的值是一個加和。

作者通過這樣一個計算來將其轉化為每個體素到口吃相關腦區a、b和c的連接概率。其中FCb二值化的全腦網絡(即有連接就是1,沒連接就是0),thr代表閾值,0就是不和口吃相關腦區任一一個存在連接,1就是和這三個腦區全連接。

圖1 口吃相關腦網絡構建和口吃、語言相關基因表達腦網絡構建

在通過上述兩種方法獲取了口吃相關網絡後,作者將口吃相關網絡和一些已經較為認可的5個語言相關網絡進行了overlap的比較。分別是聽覺-運動整合網絡、韋尼克網絡、Broca F3的島蓋部網絡、Broca F3三角部網絡和Borca F3區的眶額皮質網絡。作者通過提取口吃網絡中每個體素在上一步得出的度值得分的強度除以相應語言網絡的mask的大小,得到了口吃連通圖與其他語言相關連通圖的重疊指數。

最後,作者開始分析口吃腦網絡和相關基因表達網絡的共定位狀況。作者利用先前所描述的與口吃病例相關的基因的先驗知識,以及基於AHBA全基因組(蛋白編碼)轉錄組的數據驅動方法,來尋找口吃的神經生物學基礎下的皮層基因圖譜。詳細步驟如下,第一,作者研究了與口吃密切相關的基因,如CNTNAP2、GNPTAB、GNPTG和NAGPA,以及與語言和語言發展密切相關的基因,如FOXP2、ROBO1。作者從AHBA中獲得這些基因的表達水平(圖1的II中的第一張圖),接着,對覆蓋整個皮層的Desikan- killiany圖譜的68個預先指定的大腦區域進行了AHBA轉錄譜的解剖學轉換(Desikan et al., 2006,包括20737個蛋白編碼基因,基於對6名成人參與者的3702次大腦樣本採集中的58,692個基因表達的測量)。通過計算相應向量間的歐氏距離,研究了口吃相關基因表達數據與語言相關基因表達數據之間的空間拓撲相似性。

然後,使用Desikan-Killiany圖譜將口吃網絡圖轉換為與AHBA數據相同的空間。口吃網絡圖的每一個體素都被映射到Desikan-Killiany圖譜的一個區域(68個區域),然後計算每個區域的平均值。然後,分析了口吃的成像表型和AHBA數據的整個轉錄組(20737個基因的皮層基因表達水平)之間的空間拓撲相似性。至此,作者構建了一個基於整個蛋白編碼轉錄組的零假設分佈,在該分佈中,作者計算了口吃成像表型與特定基因之間的相似性p值。將轉錄組均值以上兩個標準差作為統計顯著性水平。

再驗證了作者的主要假設後,作者還進行了基因本體與相互作用的分析。

使用過表達分析,可以了解可能的生物學過程或細胞成分與口吃相關基因連接組的遺傳學相互作用。為此,作者採用了前一步得到的數據驅動的基因集和基因本體,使用GO二項測試來描述相關生物過程或細胞成分的基於基因注釋的功能,指定「人類」作為參考列表,而前面步驟中的數據驅動基因列表作為分析列表。此外,使用interactome 分析法來調查已識別的基因之間的遺傳相互作用,以調查超越它們在皮質中的空間協同定位的遺傳功能關係和相互作用的證據。遺傳關聯的權重是基於來自共表達、共定位、遺傳相互作用、通路、預測物理相互作用和共享蛋白域的相互作用研究結果。使用了圖論中的節點介數指標,以確定感興趣基因的特定作用。

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研究結果:

結果一:口吃腦網絡

圖2 口吃腦網絡

本文的的ALE薈萃分析在大腦皮層的幾個候選區域發現了口吃研究中的腦區,包括雙側中央前回、左側顳上回、雙側顳中回、雙側額葉內側回、右側前扣帶皮層、左側島葉和雙側下頂葉。作者在大腦皮質外也發現了兩個腦區,一個在右殼核,另一個在小腦的右八區(基於AAL索引)。圖2的I中展示了所有的皮層腦區,皮下組織和小腦區域未圖示化,但包括在了所有的分析當中。

作者的ALE分析結果與作者在自己的數據集上驗證的結果一致性很高,圖2的II中展示了CWS(兒童口吃者)的全腦FC低於NFC(普通流暢兒童)的區域,可以看出和作者基於ALE分析結果,然後根據圖論方法(即我們在方法部分所說的strategy1和strategy2)建立的口吃相關網絡的重合度很高(圖2中的stuttering network)。都發現,雙側聽區、運動區、外側翼區,特別是額頂蓋、腹側中央前回和中央後回、顳上回、前腦島、顳下回,以及中線區域,如輔助運動區和中央額區等區域的功能連接異常。

並且,這些區域中有幾個在與口吃相關的區域中扮演着重要角色,特別是額葉和頂葉的蓋區(如OP4)對a、b、c這三個區域之間起着相互連接的作用。

結果二:與語言相關腦網的重疊分析

研究發現,口吃連接網絡與其他大型語言相關網絡共享皮層拓撲結構(圖3-I和3-II)。聽覺-運動整合區、Broca s F3島蓋區和Wernicke s區與口吃網絡高度重疊。其中,圖三I展示了作者所使用的5個語言腦網絡,圖三II展示了作者根據重疊指數計算的結果。

圖3 口吃網絡和其他語言網絡的重疊分析

結果三:口吃網絡拓撲結構與大腦GNPTG基因表達存在交叉

通過分析了吃基因表達水平和語言相關基因之間的皮層相似性,發現NAGPA、GNPTG、GNPTAB和CNTNAP2,特別是NAGPA、GNPTAB和CNTNAP2表現出高度的相似性(共表達矩陣中的黑色方塊;圖4-I),而ROBO1和FOXP2形成單獨的聚類(共表達矩陣中的淺色方塊;圖4-I)。重要的是,重要的是,當所有轉錄組數據都考慮到口吃連通性圖譜的相似性評價時,只有GNPTG在口吃相關基因和語言相關基因中達到了統計學意義(圖4-II)。並且,GNPTG基因的表達水平腦網絡圖與口吃連接圖(圖4-II和圖4-III)具有高度的相似性,特別是在聽覺-運動整合區域(圖4-III中的星形符號)。

這說明,GNPTG基因在皮層的表達水平和口吃腦網絡存在顯著的重合,並且聽覺-運動整合功能區是其集中重合的區域。這一區域在口吃腦網絡研究中同樣是多個研究發現的區域,可能提示了口吃的基因表達和功能異常的重要神經底物。

圖4 口吃網絡拓撲結構與人類皮層的遺傳表達水平的共定位分析結果

結果四:口吃網絡與溶酶體和神經輕鏈功能有關

在上一個分析結果中,研究發現出來GNPTG,其他與語言相關的基因的皮層表達和口吃腦網絡也存在顯著的相似性。因此,為了評估該基因組是否存在遺傳功能的過度表達,作者進行了針對生物過程的GO分析。結果發現,與口吃皮質網絡共定位的基因表達不僅在溶酶體相關功能(如蛋白定位到溶酶體)(圖4-IV中的綠色高亮部分),而且在神經輕鏈細胞骨架組織(圖4-IV中的紅色高亮部分)中高度富集,具體涉及NEFH、NEFL和INA基因。與一般細胞過程相關的其他生物學功能也被發現,如線粒體相關轉運、蛋白膜靶向和糖酵解(見圖4-IV中完整的生物學過程列表)。

以上主要發現表明,溶酶體基因和神經輕鏈基因可能參與了口吃的大腦病理生理過程,因此,通過相互作用組(interactome)分析,探討GNPTG、NEFH、NEFL和INA基因是否在空間皮層域之外表現出遺傳相互作用。

結果發現GNPTG(圖5-I中的綠色節點)與NEFH、NEFL和INA(圖5-I中的灰色節點)通過特定的遺傳相互作用(圖5-I中的紅色和橙色節點)相互連接。與之相關的是,CDK5和SNCA在支持GNPTG和神經輕鏈組織基因之間的遺傳影響方面表現出較高的介數值(圖5-I和5-II)。這說明,SNCA和CDK5在這個過程中扮演了重要的中介連接角色。

圖5 GNPTG與神經輕鏈基因(NEFH、NEFL、INA)相互作用的介數圖

總結:

總而言之,本文通過「大海撈針」式和「按圖索驥」式的分析方法,通過對大量已有研究結果的綜合分析,通過網絡的分析方法結合基因組研究的相關方法,有效的對基因表型研究和大尺度腦網絡研究的結果起到了推進性的作用。

本研究,有助於彌補功能性神經網絡和先前與口吃相關的基因突變之間的差距。基於對兒童和成人口吃者的功能連接數據和基因表達圖譜的分析,研究發現口吃相關的功能連接網絡與溶酶體轉運基因GNTPG的基因表達共定位。這個基因和其他類似基因的突變嵌入在大腦網絡的皮層拓撲結構中,表明這些突變可以調節這些網絡的功能。

聽覺-運動整合網絡非常容易受到與GNPTG -溶酶體功能障礙相關的神經迴路功能障礙的影響。這些結果首次證明了基因突變與口吃者大腦異常連接之間可能存在的因果關係,並進一步提出了與神經纖維相關的生物學通路,這可能有助於解釋導致持續性發育性口吃的神經機制,是一項意義重大的口吃析因研究。

原文:Neurofilament-lysosomal genetic intersections in the cortical network of stuttering