TUNEL 檢測細胞凋亡(附視頻)

2019 年 10 月 4 日
筆記

細胞凋亡是生物體內細胞在特定的內源和外源信號

本教材通過 TUNEL 法檢測細胞凋亡， TUNEL，為原位末端轉移酶標記技術。其原理是：先增加細胞膜通透性，讓 rTDT 和熒光素生物素標記的 dUTP 進入細胞內，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶的輔助下將脫氧核糖核苷酸和熒光素等形成的衍生物標記到 DNA 的 3』末端，從而可進行凋亡細胞的檢測。最終通過計數每張切片上不同視野中 TUNEL 陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發生情況。

實驗前準備

在開始實驗前，確保所用到的試劑都準備到位。如：0.2% TritonX 100， TUNEL檢測試劑盒（包含 10×TdT 酶濃縮液、熒光素標記的 1×dUTP、轉化劑POD），DAB 試劑盒， 3%過氧化氫甲醇，磷酸緩衝液 PBS 等。本實驗所使用到的儀器和耗材有：芬蘭百得公司提供的移液器，賽默飛公司的 QSP 盒裝吸頭，濕盒，恆溫箱等本次 TUNEL 實驗按照以下常規步驟來展開，首先樣品處理，封閉內源性過氧化物酶干擾後進行細胞通透化。滴加 TUNEL 反應液反應後 POD 轉換， DAB顯色後在顯微鏡下觀察並進行結果分析。

樣品處理

在標有實驗組，陽性對照組和陰性對照組的切片上滴加 4%不含甲醇的甲醛室溫固定 10min。棄去甲醛，用 PBS 洗兩次，每次 5min。

封閉

用濾紙擦去周圍多餘的 PBS，滴加 3%過氧化氫甲醇，室溫孵育 10min，消除內源性過氧化物酶干擾後，棄去將載玻片用 PBS 洗 2 次，每次 5min細胞通透化去盡 PBS 後，滴加 100μl 由 PBS 配製的 0.2% TritonX 100。於濕盒中室溫孵育 5min。孵育結束後，棄去通透液， PBS 洗兩次，每次 5min。

TUNEL 反應

按照試劑盒說明書根據實驗實際用量配製好標記反應體系。實驗組和陽性對照組滴加 50μl 標記反應混合物，陰性對照組滴加 50μl 標記溶液，避光孵育30min。孵育結束後，用 PBS 洗 2 次，每次10min POD 轉化擦去周圍多餘的 PBS，每張切片滴加 50μl 的轉化劑 POD，避光反應 30min。孵育結束後， PBS 洗 2 次，每次 5min。

DAB 染色

取出載玻片，用濾紙擦去周圍多餘的PBS。滴加新鮮配製的 DAB 工作液，結合顯微鏡下觀察背景顏色變化，控制顯色時間。底面出現適量黃色時，將載玻片放入盛有蒸餾水的切片缸內，水洗終止顯色。

結果分析

陰性對照組細胞狀態良好，呈正常的梭形，背景清晰。實驗組部分細胞萎縮變圓，胞膜開始改變。陽性對照組細胞失去正常形態，變圓萎縮，並出現大量的凋亡小體。在光學顯微鏡下，結合 3 組結果分析，經過 DAB 和蘇木素復染後，凋亡細胞核被染成棕黃色，正常細胞核呈藍色。可通過實驗組凋亡細胞數判斷凋亡水平。

疑問解答

Doctor A， TUNEL 的對照實驗應該怎樣設計才好呢？設計對照實驗是TUNEL的一個關鍵點。陽性對照通常事先用DNA酶處理過,DNA被切割。它是評價應用該實驗操作準確性和可靠性的陽性標準和控制顯色時間的重要指標。陰性對照對實驗標本不加TdT，是控制結果質量的參照。特別重要的是在控制最後顯色的時間時, 應嚴格觀察陽性和陰性對照組細胞核的顯色,一旦陽性對照組細胞核顯現出棕黃色應立即停止顯色, 如果陰性對照組有背景顯色, 則提示顯色過度，可能出現假陽性結果。高質量的陽性結果是高倍鏡下細胞核被染成棕黃色的環狀, 而細胞的其他成分不顯色。 Doctor A， TUNEL 只是評估細胞凋亡的方法之一，假陽性較高，我們該怎樣綜合來檢測細胞凋亡呢？ Miss Q，這個問題很好。嚴格意義上講, TUNEL結果陽性只說明DNA斷裂後被標記並呈陽性顯色,結合DNA瓊脂電泳法觀察到180-200bp的階梯狀條帶出現,才能說明細胞的這種形態學表現符合凋亡的基本特點。細胞在凋亡的過程中內切核酸酶產生或被激活,將DNA鏈條從核小體之間切斷,正是眾多DNA片段斷端的存在,生物dUTP末端標記才出現陽性結果,而用以上兩項方法驗證細胞凋亡的技術基礎正基於此。目前流式細胞儀檢測細胞凋亡已逐漸成為趨勢，利用Annexin V-FITC和PI染色，流式細胞儀檢測早期凋亡率。Annexin V -FITC檢測凋亡。正常細胞帶負電的磷脂酰絲氨酸（PS）定位於細胞膜內側。細胞凋亡早期，由於細胞膜失去對稱性， PS從包膜的內側暴露於細胞膜外，成為巨噬細胞清除凋亡細胞識別的標誌。Annixine V-FITC是一種標記有熒光素的鈣依賴磷脂結合蛋白，與PS有很強的親和力，可特異性與PS結合，凋亡早期細胞仍保持膜的完整性，碘化丙啶（PI）不能進入細胞內，壞死細胞細胞膜破裂，只能被PI染色。而凋亡晚期的細胞可同時被Annixine V-FITC和PI着色。利用流式細胞儀進行雙參數分析，即可將凋亡細胞和繼發性壞死的細胞區分開，計算出陽性細胞百分率。並通過Western Blot檢測Caspase家族的蛋白表達來判斷細胞凋亡水平。謝謝Doctor A，那在做TUNEL的過程中，怎麼解決非特異性染色這問題呢？ TUNEL實驗是會有一定的非特異性染色，我們可以通過去除內源性酶的干擾，增加洗滌次數，調節封閉和反應時間，鏡下嚴格控制DAB染色程度來降低非特異性染色，注意在實驗過程中，勿讓切片乾涸。謝謝Doctor A一直以來的耐心指導。