MTT法檢測細胞增殖
- 2019 年 10 月 4 日
- 筆記
活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在570nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（即OD值），來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。
2.試劑及耗材
CO2細胞培養箱、生物安全櫃、倒置顯微鏡 、低速離心機、酶標儀、8道排槍、培養基 、胎牛血清 、MTT、 DMSO、96孔細胞培養板、胰酶、血細胞計數板等。
3.注意事項
（01）選擇適當的細胞接種濃度和培養時間。
（02）設置調零孔（只加培養基100ul、MTT10ul、二甲基亞碸100ul）。
（03）設置空白孔（細胞、藥物溶解介質、培養液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亞碸）。
（04）MTT實驗吸光度最後要在0-0.7之間，超出這個範圍就不是直線關係。
（05）96孔板邊緣32孔用無菌PBS填充，因為邊緣的32孔中水分蒸發很快，藥物易被濃縮，對實驗影響大。同時加入PBS液填充後，可以一定程度上保持中間孔的水分。
（06）防止藥物與MTT反應。如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉澱，這種效果可能是不需要的。
（07）吸收值分析。在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理的空白組的吸收值應該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經超出線性範圍。這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。
（08）培養過程中換液。100ul的培養液對於10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持50h以上，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨於靜止，影響結果。如果培養時間長，在48h應該換液一次。
（09）避免血清干擾。高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小於10％胎牛血清的培養液進行。在呈色後，盡量吸凈培養孔內殘餘培養液。
（10）判斷污染。如加入MTT後都有個別孔立即變為藍黑色，則污染的可能性極大。在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。
（11）加DMSO前要把液體小心吸掉。但培養液里的紫色結晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘，然後吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法，懸浮細胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板，清除上清時注意不要把下面的結晶顆粒吸掉。對於貼壁細胞，可以試着將96孔板傾斜30度角，然後用槍尖慢慢吸。
（12）MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 範圍內。MTT一般最好現用現配，0.22μm過濾後4℃避光保存兩周內，或配製成5mg/ml保存在-20℃長期保存，避免反覆凍融，小劑量分裝，用避光袋或錫箔紙包住避光以免分解，當MTT變為灰綠色時不能再用。一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那麼多，尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關係，畢竟時間較短，或者不放心的時候可以把操作台上的照明燈關掉。
4.實驗步驟：
4.1 細胞標準曲線製作
（1） 0.5%的胰酶消化對數期細胞，待細胞即將脫離皿底時，加少量血清終止反應，1000r/min，離心5min，吸去上清，將細胞沉澱用培養基吹打混勻，製成細胞懸液，細胞計數後調整其濃度至5-10×10^4/ml。
（2）取4塊96孔板，分別標記為0h、24h、48h、72h，，每組設置3個復孔，每孔加入100 μL細胞懸液，每板分別鋪8組細胞，分別為3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000個/孔，邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應。
（3）5%CO2，37℃培養箱繼續培養，每24 h取出一塊96孔板檢測：
a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），繼續細胞培養箱培養4-6h；
b) 小心吸去孔內培養液（用移液器吸取孔內培養液，吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取，不要觸碰底部的紫色結晶。或者將96孔板倒扣於濾紙上來吸取孔內的培養液）；
c) 每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解後，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內孵育 10～20 min，這樣有助於 DMSO對紫色結晶物的溶解（尤其在冬天））；
d) 加DMSO後10min內，用酶標儀檢測各孔波長490nm的吸光值；
（4） 標準曲線製作
以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪製細胞增殖標準曲線。選擇合適的細胞濃度進行實驗。
4.2 MTT藥物毒性實驗步驟
（1）0.5%的胰酶消化對數期細胞，加少量血清終止反應，1000r/min，離心5min，吸去上清，將細胞沉澱用培養基吹打混勻，製成細胞懸液，細胞計數後調整其濃度至5-10×104/ml，藥物毒性實驗一般每孔細胞數量5000—10000個（具體數目根據預實驗判斷）。此外，還應根據細胞本身特性，如生長快慢，來決定細胞數量。比如：生長較快的細胞密度可略小。下面是幾種常見的細胞接種數量(來源於網絡，僅供參考）。
（2）將細胞懸液製備好後，輕輕混勻，每孔加入90μl細胞懸液, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無菌PBS填充）。
注意：因細胞在混勻後仍要繼續沉降，因此接種的過程中要反覆多次混勻，如每加5個孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間完全相同，這對於MTT的結果至關重要。
（3）5%CO2，37℃培養箱繼續培養，待細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物。（原則上，細胞貼壁後即可加藥，或兩h，或半天時間，但我們實驗室常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。加藥時按照所需的濃度在EP管中先稀釋好，每孔加入10μl已經稀釋好藥物，使每孔最終體積為100μl，為了避免產生誤差，稀釋好的藥物體積應略大於所需藥物的體積。需要注意的是，以DMSO 作為溶劑溶解的藥物至少需要進行100倍以上稀釋才能使用，因為作用於細胞DMSO的含量高於1%時，DMSO會殺死細胞從而影響判斷。）
（4）按照藥物作用時間點，每24 h取出一塊96孔板檢測：
a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），繼續細胞培養箱培養4-6h；
b) 小心吸去孔內培養液（用移液器吸取孔內培養液，吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取，不要觸碰底部的紫色結晶。或者將96孔板倒扣於濾紙上來吸取孔內的培養液）；
c) 每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解後，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內孵育 10～20 min，這樣有助於 DMSO對紫色結晶物的溶解（尤其在冬天））；
d) 加DMSO後10min內，用酶標儀檢測各孔波長490nm的吸光值；
（5）同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸）。
（6）MTT結果分析
關於如何計算IC50，使用改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大劑量
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應率之和
Pm:最大陽性反應率
Pn:最小陽性反應率
舉個例子：各藥物濃度作用於某腫瘤細胞後所得MTT值如下：
公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對於100ug/ml的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下：
代入計算公式：
Pm=0.869
Pn=0.135
P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142
Xm=lg100=2
lgI=lg100/50=0.301
lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655
IC50=45.186
該藥物的IC50值為45.186ug/ml，IC50值也可以通過Graphpad prism7進行計算，具體可參考文章：
https://jingyan.baidu.com/article/fd8044fa19f4065030137a60.html；
https://www.graphpad.com/guides/prism/7/curve-fitting/index.htm?reg_dr_inhibit_variable.htm
4.3 MTT增殖實驗
（1）分別收集各組對數期的細胞，調整細胞懸液濃度；
（2）取4塊96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，鋪板使待測細胞為5×10^3 cell/孔（邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應），每組設置3個復孔；
（3）5%CO2，37℃培養箱繼續培養，每24 h取出一塊96孔板檢測：
a) 每孔加入20 μL MTT溶液（5mg/ml），繼續細胞培養箱培養4h；
b) 小心吸去孔內培養液（用移液器吸取孔內培養液，吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取，不要觸碰底部的紫色結晶。或者將96孔板倒扣於濾紙上來吸取孔內的培養液）；
c) 每孔加入150μL DMSO，使結晶物充分溶解（加入 DMSO 溶解後，將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內孵育 10～20 min，這樣有助於 DMSO對紫色結晶物的溶解（尤其在冬天））；
d) 加DMSO後10min內，用酶標儀檢測各孔波長490nm的吸光值。
（4）數據處理及MTT增殖曲線繪製。
