star-fusion得到的融合基因結果還需要可視化哦

2019 年 11 月 22 日
筆記

我們多次在生信技能樹公眾號介紹過star-fusion這個目前最好的針對RNA-seq測序數據找融合基因的軟件：：最好用的融合基因查找工具終於正式發表了，還有一個踩過的坑需要注意：一個好像沒有做任何改變的參數但是關於融合基因的後續生物學介紹我們說的不夠，現在就帶領大家仔細理解一下star-fusion軟件的結果！

我們的示例項目得到的結果，按照JunctionReadCount排序如下：

#FusionName    JunctionReadCount   SpanningFragCount  FGFR3--TACC3    773 1087  IGL-@-ext--PRAMENP    216 1343  IGL-@--PRAMENP    216 1343  IPO7--LINC02489    186 1724  PPFIA1--TSGA10IP    141 213  RNF121--COBL    125 6  [email protected]    121 0  [email protected]    121 0  IGL-@-ext--FLOT2    108 1  IGL-@--FLOT2    108 1

按照SpanningFragCount排序如下：

IPO7--LINC02489    186 1724  IGL-@-ext--PRAMENP    216 1343  IGL-@--PRAMENP    216 1343  FGFR3--TACC3    773 1087  NFKB2--AC025062.3    82  770  IGL-@-ext--PRAMENP    25  366  IGL-@--PRAMENP    25  366  FOXP1--IGL@-ext    9   345  FOXP1--IGL@-ext    28  345  FOXP1--IGL@-ext    27  345

其中FGFR3–TACC3這個融合基因事件我們比較熟悉了，就拿它為例子講解如何理解這個融合現象，首先查看具體信息：

FGFR3--TACC3    773 1087    ONLY_REF_SPLICE  FGFR3^ENSG00000068078.18    chr4:1806934:+  TACC3^ENSG00000013810.19    chr4:1735731:+  YES_LDAS    33.6089 GT  1.8892  AG  1.9656  # 下面的是FusionAnnotator (bundled with STAR-Fusion)注釋結果的整合  ["Cosmic","ChimerPub","YOSHIHARA_TCGA","TumorFusionsNAR2018",  "ChimerKB","ChimerSeq","CCLE_StarF2019","TCGA_StarF2019",  "GUO2018CR_TCGA","Klijn_CellLines","INTRACHROMOSOMAL[chr4:0.05Mb]",  "LOCAL_REARRANGEMENT:+:[48117]"]

可以看到4號染色體的兩個臨近基因的融合

首先IGV可視化

得到的結果通常是需要可視化，如果我們單獨的IGV可視化FGFR3基因如下：

如果我們單獨的IGV可視化TACC3基因如下：

可以看到這兩個基因都有點長，我們的NGS測序也就100bp罷了，它們兩個基因都是幾十個Kb長度。所以這樣是無法瀏覽融合事件的，需要採用高級工具，比如FusionInspector

然後使用FusionInspector仔細檢查

它雖然說是star-fusion御用小工具，但不限於star-fusion的融合事件的檢查，可以是其它一系列軟件出來的融合基因結果，包括：Prada, FusionCatcher, SoapFuse, TophatFusion, DISCASM/GMAP-Fusion, STAR-Fusion, or other), 的檢查。因為它的輸入數據要求很簡單，就是兩個基因的融合關係，如下：

B3GNT1--NPSR1  ZNF709--DYRK1A  ZNF844--NCBP2  RBX1--HAPLN2  FAM180B--TRIM60  CASP9--ADCYAP1  HS3ST3A1--C1QTNF2  OPTC--AP000347.4  GRIA2--ZW10

運行FusionInspector工具：

conda install -c bioconda fusion-inspector    bin_star='~/biosoft/STAR-2.7.3a/bin/Linux_x86_64/STAR'  lib='~/biosoft/starFusion/db/GRCh38_gencode_v31_CTAT_lib_Oct012019.plug-n-play/ctat_genome_lib_build_dir/'  FusionInspector  --fusions SRR2016940_fusionList.txt   -O SRR2016940  --genome_lib $lib    --left_fq ~/clean/SRR2016940_1_val_1.fq.gz     --right_fq  ~/clean/SRR2016940_2_val_2.fq.gz   --out_prefix finspector   --vis

FusionInspector工具其實是一個打包好的流程，中間過程太多，而且大多數是perl代碼，就不一一介紹了，其中最後居然是使用 create_fusion_report.py 這個python代碼出報告。如果你沒有安裝 https://github.com/FusionInspector/fusion-reports 工具，就會報錯：

cd ~/miniconda3/envs/rna/share/fusion-inspector-2.2.1-0/fusion-reports/  git clone https://github.com/FusionInspector/fusion-reports.git  pip install igv_reports    ~/miniconda3/envs/rna/share/fusion-inspector-2.2.1-0/fusion-reports/create_fusion_report.py   --html_template ~/miniconda3/envs/rna/share/fusion-inspector-2.2.1-0/util/fusion_report_html_template/igvjs_fusion.html   --fusions_json ~/fusion/FI/finspector.fusion_inspector_web.json   --input_file_prefix finspector   --html_output ~/fusion/FI/finspector.fusion_inspector_web.html

沒有html報告問題不大，我們可以把數據文件載入到IGV自己進行可視化，需要下面的4個文件：

finspector.fa : the candidate fusion-gene contigs (if you copy things elsewhere, make sure to als copy the index file finspector.fa.fai)  finspector.bed : the reference gene structure annotations for fusion partners  finspector.junction_reads.bam : alignments of the breakpoint-junction supporting reads.  finspector.spanning_reads.bam : alignments of the breakpoint-spanning paired-end reads.

載入IGV即可，當然了，這個時候需要對IGV有一點認識才行！

如果要批量檢驗全部樣本的star-fusion結果呢

就需要寫自動化批量處理的腳本了。這個很難哦，感覺寫出來了能看懂的也不多，就算了吧！需要認真學好linux，參考我在《生信分析人員如何系統入門Linux(2019更新版)》設定的linux入門6個階段 ，一般來說，每個階段都需要至少一天以上的學習：

第1階段：把linux系統玩得跟Windows或者MacOS那樣的桌面操作系統一樣順暢，主要目的就是去可視化，熟悉黑白命令行界面，可以僅僅以鍵盤交互模式完成常規文件夾及文件管理工作。
第2階段：做到文本文件的表格化處理，類似於以鍵盤交互模式完成Excel表格的排序、計數、篩選、去冗餘，查找，切割，替換，合併，補齊，熟練掌握awk,sed,grep這文本處理的三駕馬車。
第3階段：元字符，通配符及shell中的各種擴展，從此linux操作不在神秘！
第4階段：高級目錄管理：軟硬鏈接，絕對路徑和相對路徑，環境變量
第5階段：任務提交及批處理，腳本編寫解放你的雙手
第6階段：軟件安裝及conda管理，讓linux系統實用性放飛自我