实验复盘（三）提RNA降解还反转？
- 2019 年 10 月 29 日
- 筆記
这一次的实验复盘，想好好总结一下最基本的分子实验操作——提取RNA反转成cDNA 应用：可以用于基因表达定量/非定量，比如说RT-PCR，RT-qPCR等等
part 1
简单说一下我用到该实验技术的目的： 1，想要检测一下这个外源导入的基因是不是表达（可以不需要定量，看最后有无PCR条带就可以） （如果是蛋白表达的话，还可以去做western-blot看看蛋白的表达情况，但是得需要有相应的抗体去体现，如果表达量比较低的话，wb的效果不会很直观了，而且wb的效果与抗体的效价关系很大。） 2，如果要检测外源基因的具体表达情况（需要定量，则需要做qPCR） （这个时候需要用内参基因，如actin，GAPDH等去当对照去定量）
这里需要说一下，RT-PCR和RT-qPCR是不一样的，RT-PCR的话最终呈现形式是跑胶看有没有目的条带，但是RT-qPCR的话是需要去看cq值去定量。
part 2
2.1 关于提取RNA原理方法：
一：试剂盒提取的方法 二：Trizol法 这里上一个之前用过的提取RNA的protocol : https://medicine.yale.edu/keck/ycga/Images/TRIZOLRNAIsolation_092107_tcm240-21453.pdf
1: Trizol法基本的是Trizol裂解细胞，到氯仿抽提，异丙醇沉淀，再用75%的乙醇洗，最后晾干加DEPC水溶解。 2: 有些试剂盒也是利用Trizol的原理去提RNA，但是不同的裂解buffer可能会不同，万变不离其宗 3：试剂盒的话，仔细阅读说明书，有些组分得自己备好，现配现用
2.2 关于提取RNA的注意事项：
1：戴好手套，口罩，穿好实验服，因为人体自带核酸降解酶 2：用RNAase free的枪头 3：台子和移液枪提前用酒精喷一遍，保持台面干净 4：一定要确定溶RNA的水没有问题！！！！！首推DEPC水！！！！！ （RNA降解的速度是非常的快的。。。。。。）
提过RNA的童鞋都知道，好的RNA跑胶一般是可以看到3条带的，分别是28S,18S,5S，但是如果RNA降解里的话是看不清楚的。条带“糊”掉 （PS：跑胶前把电泳槽里的液体换掉，还有可以跑快一点，电压调高，防止跑胶过程中RNA降解的太快） 上一张正常的RNA跑胶图：
正常RNA跑胶图
再上一张残忍的翻车图：
RNA降解情况
part 3 还能反转？
一般来说，大家都是重做了，但是我的样品太特殊了，重做代价很大，硬着头皮反转了，结果证明还是可以的（基于上面降解的PCR图情况），但是还是和实验目的有关系，如果是做qPCR的话成功的概率比较大，如果要P片段比较长的PCR的话，成功概率会降低一些。
策略： 1：加大RNA反转的起始量 2：加入oligdT+随机引物一起反转 3：延长反转的时间 4：稍微提高反转的温度（看反转的酶的情况，我试过50℃反转）
第一点，我是用4ug的RNA做的反转（看试剂的最大量情况，有的试剂盒反转起始量最多1ug，有的5ug，针对这种RNA降解的情况，肯定得多加一点）
第二点，如果是看表达的话，一般会用oligdT，然后长的反转时间（45-50min）,这种是看基因表达的情况，但是如果RNA降解的厉害不推荐，因为亲测，反转后PCR是一片smear！
oligdT+随机引物： 随机引物它对RNA模板不同区域没有偏好性。两种引物都加，目标mRNA的反转录的cDNA是更容易获得能扩增出目的片段的引物模板 因为oligo dT引物针对的事RNA里的mRNA，而随机引物是针对所有RNA模板，这样两种引物逆转录所产生的cDNA量不一样。针对qPCR来说，本质是不求长，求多啊
反转时 37℃换成50℃可以提高cDNA的量（这个得看翻转酶，有必要可以问一下技术支持确认）
最后上一张PCR结果图，还是可以P出来的！
RT-PCR结果
敲重点！！RNA发生降解，会影响qPCR的Ct值，即使使用内参基因校正，依旧会造成定量结果出现误差，不能精确反应样本间的基因表达量的差异。Fleige S等人做过实验，RNA的降解对于基因的定量差别很大。（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16900335）
感觉还是挺幸运的，提取RNA虽然简单，但是也得小心和注意！ 祝大家好运呀！
Ref: 1: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16900335
